His标签蛋白纯化面面观——His标签蛋白纯化流程

提到His标签，大家一定都不陌生。His标签是一个只有6个组氨酸的小标签，但神通广大。首先，His标签比较小，对蛋白结构和功能影响较小，一般纯化后也可以无需切除；其次，His标签可以和其他标签一起使用，增加纯化的纯度；此外，His标签也可以在变性条件下进行蛋白纯化，适用于特殊的操作或者包涵体纯化；最后，His标签蛋白的纯化方式多样，纯化工艺也非常成熟，可以选择重力操作和离心操作，也可以选择AKTA纯化系统。

His标签如此好用，各位是不是也跃跃欲试了呢？今天小优给大家整理了我们使用频率很高的重力纯化以及仪器纯化的操作流程，一起来看看吧！

 

重力纯化：以cytiva品牌Ni Sepharose 6FF 填料（17531806）为例

 

1.缓冲液配制

按照以下配方进行缓冲液配置：

①结合缓冲液：20mM磷酸钠缓冲液，0.5M氯化钠，20-40mM咪唑，PH7.4

②洗脱缓冲液：20mM磷酸钠缓冲液，0.5M氯化钠，500mM咪唑，PH7.4

缓冲液配置完成后需要预先过滤和超声去除气泡。

 

2.样品准备

样品应完全溶解。为了避免色谱柱堵塞，建议离心并通过0.45 μm过滤器过滤，以去除细胞碎片或其他颗粒物质。如果样品溶解在20mM磷酸盐缓冲液(0.5 M NaCl，pH 7.4)以外的缓冲液中，将其NaCl浓度调整为0.5 M, pH为7-8

 

3.纯化前准备

①PD-10重力空柱（17043501）准备。用20%的乙醇洗涤滤膜，用蒸馏水润洗滤膜，然后将滤膜放入PD-10空柱；

②填料准备。将需要量的填料悬浊液从瓶中转移到离心管中，用500xg离心5min以沉淀填料。除去上清，加入适量蒸馏水，轻柔的振荡填料悬浊液3min，用500xg离心 5min。除去上清，加入适量结合缓冲液进行平衡，轻柔的振荡填料悬浊液3min，用500xg离心 5min。然后把填料悬浊液转移到量筒中，再加入适量体积的结合缓冲液，使悬浊液中的填料浓度达到50%。

 

4.重力柱纯化

①将样品加入含有50%填料的悬浊液中（样品在上柱前要进行离心和过滤）。Ni Sepharose 6FF的平均载量是40mg/ml。则1ml的50%悬浊液的载量为大约20mg蛋白。

②将样品和填料混合物在摇床上低速混合1h。

③将样品和填料混合物加入到PD-10的空柱中，收集流出物。

④用结合缓冲液洗涤2-5个柱体积，收集流出物。

⑤用4个柱体积的洗脱缓冲液洗脱，收集流出物。

 

5.检测

对流出物进行检测分析，跑胶鉴定

 

仪器纯化：以cytiva品牌HisTrap FF 预装柱（17531901）为例

 

1.缓冲液配制

按照以下配方进行缓冲液配置，

①结合缓冲液：20mM磷酸钠缓冲液，0.5M氯化钠，20-40mM咪唑，PH7.4

②洗脱缓冲液：20mM磷酸钠缓冲液，0.5M氯化钠，500mM咪唑，PH7.4

缓冲液配置完成后需要预先过滤和超声去除气泡。

 

2.样品准备

样品应完全溶解。为了避免色谱柱堵塞，建议离心并通过0.45 μm过滤器过滤，以去除细胞碎片或其他颗粒物质。如果样品溶解在20mM磷酸盐缓冲液(0.5 M NaCl，pH 7.4)以外的缓冲液中，将其NaCl浓度调整为0.5 M, pH为7-8

 

3.系统准备与装柱

①系统设置一个低流速，移除预装柱顶部的堵头，把柱子连接到ӒKTA纯化仪的接头上，注意要液滴对液滴进行连接，防止引入气泡。

②去除柱子底部的堵头，连接到纯化仪上。

③用3-5个柱体积的蒸馏水洗去乙醇。

④用5个柱体积的结合缓冲液平衡柱子，建议流速是1ml/min（1ml 体积柱子）。

 

4.上样

用上样环或者 superloop 加入预处理的样品（样品在上柱前一定要进行离心和过滤），在上样时建议流速为 0.2-1ml/min（1ml 体积柱子）。

 

5.洗杂

用结合缓冲液洗涤至少10-15个柱体积，直到吸收峰达到稳定基线或在流出物中没有物质流出。洗涤过程中建议保持流速为1-2ml/min（1ml 体积柱子）。

 

6.洗脱

用洗脱缓冲液采用一步洗脱或者线性梯度洗脱（拉咪唑浓度梯度）。一步洗脱通常5个柱体积，线性洗脱通常10-20个柱体积。在洗脱过程中保持流速为1-2ml/min（1ml体积柱子）。

 

7.清洗与保存

洗脱后，用3-5个柱体积的结合缓冲液洗涤柱子，然后加入20%乙醇。拧上柱子上下的堵头，防止柱子变干。

重力法的操作简便，易于控制层析柱液体的流动，而且也容易确定目的样品收集的起点与终点；但由于液体的流动是重力驱动的，过柱速度较慢，一次纯化实验可能耗费较长的时间。而使用纯化仪器+预装柱的方法，则可以更加轻松准确的进行实验。HiTrap型预装柱除了可以连接在层析系统中使用，也可以连接注射器手动操作，或者连接在恒流泵（蠕动泵）上运行。

总的来说，His标签蛋白纯化主要包括前期样品、相关试剂和耗材的准备，在纯化这一块，都是标准的平衡-上样-清洗-洗脱-再生-保存的流程。

在蛋白纯化领域，我们也可以给大家提供很多的精品资源。例如标签蛋白纯化解决方案https://www.univ-bio.com/study-center/solution/PPP.html为大家详细介绍原核细胞标签蛋白纯化从质粒构建到蛋白表达到蛋白纯化每个过程的详细步骤以及操作技巧，有需要的同学戳链接自取哦！

cytiva预装柱和填料方面可供选择的产品较多，除了今天的高流速FF系列，还有高流速HP和高耐受Excel系列等等，不同材料之间的特点如下图所示，帮助您快速选择所需产品。

部分His标签蛋白纯化产品

货号	品名	规格	特点
29051021	HisTrap HP	1 × 1 mL	高分辨率
17524701	HisTrap HP	5 × 1 mL	高分辨率
17531901	HisTrap FF	5 × 1 mL	高流速
17525501	HisTrap FF	5 × 5 mL	高流速
17371205	HisTrap excel	5 × 1 mL	耐受EDTA和DTT，低脱镍
28953766	HiTrap TALON crude	5 × 1 mL	钴离子，纯度更好
17092102	HiTrap IMAC FF	5 × 1 mL	自行偶联金属离子，拓展性更好
17526801	Ni Sepharose HP	25ml	高分辨率
17531801	Ni Sepharose 6 FF	25ml	高流速
17371201	Ni Sepharose excel	25ml	耐受EDTA和DTT，低脱镍
28957499	TALON Superflow	10ml	钴离子，纯度更好
17092107	IMAC Sepharose 6 FF	25ml	自行偶联金属离子，拓展性更好
17043501	PD-10空柱	50个	重力空柱