除了常规的酶切连接外，你还了解其他的分子克隆技术吗？

对于做过分子实验的小伙伴来说，传统的分子克隆技术——酶切连接大家应该都是比较熟悉的，那么对于其他的分子克隆技术类型大家有了解过吗？根据不同的实验需求，来选择不同的分子克隆技术以及产品。本期，大家和小编一起来了解下几种常规的分子克隆技术吧。

 

一、酶切连接

酶切连接法属于经典的分子克隆方法，利用限制性内切酶切割DNA和利用DNA连接酶连接DNA，最后转化筛选及纯化，完成重组基因的大量制备。

图1 酶切连接流程

成功的酶切和有效的连接是分子克隆实验圆满完成的必要条件。限制性内切酶能特异性地结合于能被限制性内切酶识别的DNA序列之内或其附近的特异性位点上，并切割双链DNA。根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否有修饰酶活性,可分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型三类。分子克隆技术中最常用的是Ⅱ型酶,切割后得到的是带粘性末端或平末端的线性DNA。粘性末端，即限制性内切酶在DNA双链上交错切割，形成的核苷酸顺序互补的，可形成氢键的末端（见图2）。平齐末端，限制性内切酶在DNA双链的相同位置切割DNA分子，这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片断（见图3）。

图2 EcoR I切割DNA形成粘性末端DNA片段

图3 AluI切割DNA形成平末端DNA片段

爱必信拥有目前常用的如快速内切酶BsaI（abs60206）、快速内切酶ClaI（abs60209）、快速内切酶EcoRI（abs60213）、快速内切酶HindIII（abs60217）等在内的四十多款限制性内切酶。

表1 爱必信限制性内切酶介绍

货号	产品名称	规格	产品特点
abs60200	快速内切酶ApaLI	200T	快速酶切 5-15min即可完成酶切； 通用的buffer 大大简化了酶切反应； 高保真 极低的星号活性； 高度冗余 轻松应对过量、复杂底物； 完美兼容 经验证所有Absin快速内切酶与其他品牌酶切体系相互兼容。
abs60201	快速内切酶AscI	50T
abs60202	快速内切酶AvrII	25T
abs60203	快速内切酶BamHI	500T
abs60204	快速内切酶BclI	125T
abs60205	快速内切酶BglII	100T
abs60206	快速内切酶BsaI	50T
abs60207	快速内切酶BstBI	100T
abs60208	快速内切酶BstEII	100T
abs60209	快速内切酶ClaI	50T
abs60210	快速内切酶DpnI	50T
abs60211	快速内切酶DpnII	50T
abs60212	快速内切酶EagI	25T
abs60213	快速内切酶EcoRI	600T
abs60214	快速内切酶EcoRV	200T
abs60215	快速内切酶Esp3I(BsmBI )	30T
abs60216	快速内切酶FspI	50T
abs60217	快速内切酶HindIII	500T
abs60218	快速内切酶HinfI	500T
abs60219	快速内切酶HpaI	50T
abs60220	快速内切酶KpnI	200T
abs60221	快速内切酶MluI	100T
abs60222	快速内切酶MnlI	50T
abs60223	快速内切酶NcoI	30T
abs60224	快速内切酶NdeI	200T
abs60225	快速内切酶NheI	30T
abs60226	快速内切酶NotI	50T
abs60227	快速内切酶NruI	50T
abs60228	快速内切酶NsiI	25T
abs60229	快速内切酶PacI	25T
abs60230	快速内切酶PstI	500T
abs60231	快速内切酶PvuII	200T
abs60232	快速内切酶SacI	100T
abs60233	快速内切酶SacII	50T
abs60234	快速内切酶SalI	200T
abs60235	快速内切酶SbfI	25T
abs60236	快速内切酶SmaI	100T
abs60237	快速内切酶SpeI	50T
abs60238	快速内切酶SphI	50T
abs60239	快速内切酶SspI	60T
abs60240	快速内切酶StuI	100T
abs60241	快速内切酶TaqI	200T
abs60242	快速内切酶XbaI	500T
abs60243	快速内切酶XhoI	500T
abs60244	内切酶SgeI	250U

核酸片段可以通过连接酶的作用连接起来而获得重组分子。DNA接酶催化双链DNA子中相邻碱基的5’-P末端与3-0H间形成3’,5’-磷酸二酯键。常用的DNA连接酶是T4 DNA连接酶——T4 DNA Ligase（abs60084），被称为生物界的“502”。在有Mg²⁺和ATP存在的条件下，T4 DNA Ligase能催化双链DNA或RNA上相邻的5´-磷酸末端和3´-羟基末端形成磷酸二酯键。该酶不仅能够催化双链DNA的平末端或粘性末端之间的连接，还可以修复双链 DNA、RNA或 DNA/RNA 杂交双链中的单链切刻，但不能催化单链DNA之间的连接。

图4 T4 DNA连接酶作用位点

 

二、TA克隆

TA克隆是指把PCR片段与一个具有3‘-T突出的载体DNA连接起来的方法。可用于不清楚目的基因的DNA序列，获得的目的片段通常需要通过TA克隆的方法重组到T-载体中，通过测序测定DNA序列。爱必信T-Vector快速克隆试剂盒（abs60085）是高效、便利的PCR产物克隆专用试剂盒。

爱必信T-Vector快速克隆试剂盒（abs60085）产品特点：
1、阳性率高：高纯度酶切型线性T载体，连接效率更高，蓝斑率低于10% 。
2、方便快捷：预混连接反应体系，最快5分钟实现连接，无需纯化，直接转化。
3、T Simple载体无常用酶切位点，利于含酶切位点基因克隆。
4、无NdeI或NcoI位点，便于重组表达基因的克隆。
5、提供纯化的PCR片段作为阳性质控对照 。
6、 蓝白筛选：高表达活性的β-半乳糖苷酶，显色更快更深 。
7、批次稳定：遵循标准化生产流程，经过严格的质量检测。

图5 TA克隆流程

 

三、无缝克隆

无缝克隆技术是一种新的、快速、简洁的克隆方法，可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA的片断的插入，而不需要任何限制性内切酶和连接酶，只需要一步重组法，即可得到高效率克隆的重组载体，大大提高了工作效率。爱必信快速多片段DNA组装预混液（abs60250）就是基于重组原理的无缝克隆技术，它不依赖繁琐的酶切、连接步骤，也不需要末端补平等操作，依据DNA片段与线性化载体末端的15~25 nt同源序列的重组，可将插入片段克隆至任意线性载体的任意位点，载体自连背景极低，是一种简单、快速、高效的DNA定向克隆技术。

爱必信快速多片段DNA组装预混液（abs60250）特点：

1.简单便捷：兼容PCR产物体系与载体酶切体系，省去繁琐的纯化步骤；

2.高阳性率：定向克隆单个DNA片段至载体上，阳性率高于95%；

3.快速反应：反应时间大大缩短，最快仅需5min。

4.单片段、多片段均可连接：单个或多个片段同时插入，省去重复纯化与酶切过程。

图6 爱必信快速多片段DNA组装预混液（abs60250）无缝克隆操作流程

 

四、TOPO克隆

TOPO克隆实际是基于拓扑异构酶的克隆技术，关键是拓扑异构酶。该技术不需要限制性内切酶或外源连接酶，从而提供了将新的PCR产物克隆到质粒中的极其简便快捷的方法。

表2 爱必信TOPO克隆产品

货号	产品名称	规格	产品特点
abs60091	T-Vector pTOPO快速克隆试剂盒	20T/100T	快捷，不需连接酶，克隆三步到位
abs60094	Blunt pTOPO快速克隆试剂盒	20T/100T
abs60095	pBM16A Toposmart快速克隆试剂盒	20T/3×20T
abs60096	pBM27 Toposmart快速克隆试剂盒	20T/3×20T

 

五、Geteway克隆

Geteway克隆利用位点特异重组实现目的片段的插入的，载体上的一段目的片段在重组酶的作用下会替换成目的片段，不依赖限制性内切酶和连接酶，导入目的基因不需要开环处理，载体需要用试剂盒提供的载体，一般需要用到两个载体，快速、高效将DNA序列转移到载体上的克隆。