mRNA常见FAQ合集Ⅰ/有问题先找FAQ!

Q1:线性mRNA各组件概念及功能?

图1 线性mRNA结构示例

 

A1：

（1）5’-Cap：通常作为mRNA的起始结构，帽子结构可以使得mRNA进入体内以后开始翻译，并维持mRNA的稳定性。

（2）UTR（Untranslated Regions）：即非翻译区，是mRNA分子两端的非编码片段。5'-UTR从mRNA起点的甲基化鸟嘌呤核苷酸帽延伸至AUG起始密码子，3'-UTR从编码区末端的终止密码子延伸至多聚A尾巴（Poly-A）的前端。5'-UTR，可以提高mRNA在体内翻译的效率；3'-UTR,可以提高mRNA的翻译效率。

（3）CDS序列（Coding sequences）：一般可以在NCBI上查到，是与蛋白区域一一对应的序列，并且序列中间不存在其他与蛋白无关的序列，和真实情况最为接近。不同物种的CDS序列有一定的偏好性，因此，对CDS区域进行广泛的筛选和设计显得尤为关键，优化的CDS区域不仅可以提高mRNA的翻译效率，同时修饰碱基的使用，可以进一步的降低mRNA在体内的免疫原性，增强药物表现。开放阅读框ORF（Open reading frame）它是理论上的蛋白编码区，一般是先在序列中寻找起始密码子（AUG）对应的序列ATG，然后按每3个碱基一组向后延伸，一直到出现终止密码子（UAG、UGA、UAA）对应的序列。

（4）Poly(A)tail：进一步提高mRNA的稳定性，提高mRNA的翻译效率。

 

Q2:环状RNA中IRES结构及功能？

 

图2 环状mRNA结构示例

 

A2：IRES为核糖体的结合位点，该结构可启动环状mRNA的翻译，它跟线性mRNA的帽结构类似。IRES避免了环状mRNA必须添加昂贵的5’端帽子和繁琐的Poly(A)尾巴。

 

Q3：环状RNA环化的方式是什么？

A3：参考Anderson发表的文章，本公司环状mRNA环化的方式是添加同源臂内含子自剪切方式。

 

Q4：线性mRNA中5种修饰碱基各有什么区别和作用？

A4：不同核苷酸修饰表现出不同的功能和作用,其中假尿苷修饰和甲基假尿苷修饰是应用最为广泛的,具体选择哪一种修饰应当根据实验确定。

①Pseudo-UTP (Ψ)假尿苷：改变密码子、增强转录本稳定性和应激反应应答。降低mRNA免疫原性,提高mRNA稳定性并增强其翻译能力；

②N1-Methylpseudo-UTP (mΨ)甲基假尿苷：通过增加核糖体密度以elF2α依赖性和独立机制增强翻译,比假尿苷修饰更能降低mRNA免疫原性,并可增强mRNA的蛋白表达能力。

③N6-Methyl-ATP (m6A)：与mRNA稳定性、剪接加工以及microRNA 加工有关,可促进mRNA翻译。

④5-Methyl-CTP (5mC): 5mC修饰连同多种效应酶,执行多种功能; 5mC的分布因细胞类型而异,在mRNA特定位置上的5mC修饰表现出不同的调控活性:它们可以促进或抑制翻译。

⑤5-Methoxy-UTP(5moU)：可以降低所得mRNA的免疫原性,促进蛋白表达,对炎性巨噬细胞反应的诱导可忽略不计。

 

Q5:修饰碱基、帽结构一般推荐什么或者通用的是什么？

A5:我司一般用N1-甲基-假尿苷（N1-Methylpseudo-UTP）修饰碱基进行合成产品。通用帽结构采用的是Cap1 AG（化学共转录法加帽），客户若有附加质控，我们可提供Cap ratio检测。

 

Q6：Fluc mRNA表达的是什么荧光素？

A6：FLuc mRNA表达了一个最初从萤火虫中提取的萤光素酶蛋白，可以催化萤火虫萤光素D-Luciferin氧化成发光物质，发出黄绿色萤光。

 

Q7: Fluc-mRNA带cy5荧光标记的，做实验的时候需要避光吗？

A7: 最好将Fluc-mRNA进行避光实验操作、避光保存，因为要防止荧光淬灭影响实验结果。

 

Q8: mRNA保存条件是什么？

A8:需要低于-40°C保存，-80℃冰箱或液氮保存都可以，爱必信所提供的均为新鲜生产的产品，为了达到最佳使用效果，请在收到货物的2个月内使用。若不小心将mRNA短期（例如1天）存放于-20℃，可以在正式实验之前将mRNA跑琼脂糖凝胶电泳看其是否降解。

 

Q9：mRNA未添加帽结构一般可以存放多久呢？

A9：mRNA添加了加帽结构我们建议可以-40℃保存2个月，未加帽的mRNA需要尽快使用，因为未添加帽结构的mRNA稳定性会降低，mRNA会受到核酸外切酶的降解。

 

Q10: mRNA保存液主要有哪几种？有什么区别？

A10:我司的mRNA保存溶剂主要有柠檬酸钠盐溶液和无核酸酶水两种。柠檬酸钠盐溶液更适合动物体内的生理环境，如果是注射动物可以选择用柠檬酸钠盐溶液保存mRNA；如果是mRNA做包裹后推荐使用无核酸酶水进行保存；如果是做细胞处理实验，无核酸酶水及柠檬酸钠盐溶液都可以选择，任选其一即可。

 

Q11:工具RNA的溶剂是什么？

A11: 我司的工具mRNA通用溶剂一般是1mM柠檬酸钠盐溶液，pH为6.4。

 

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备注：所有线性RNA均使用Cap AG结构共转录加帽，修饰碱基5种可任选其一（5-Methoxy-UTP，5-Methyl-CTP，N1-Methylpseudo-UTP，N6-Methyl-ATP，Pseudo-UTP。）

 

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