检测细胞凋亡关键特征的七大法宝

细胞死亡在稳态中起着重要作用。它是对各种压力条件的一种生理反应，如感染、氧化压力等。细胞死亡途径的失调导致了许多人类疾病。因此，对其机制的全面了解将增长我们的知识，并有助于开发新的治疗方法。细胞死亡涉及到不同的细胞途径。其中之一是细胞凋亡，它是一种程序性细胞死亡途径。细胞凋亡途径是高度保守的，涉及到一个复杂的能量依赖的分子事件级联。有两种主要的凋亡途径：外在或死亡受体途径和内在或线粒体途径。然而，现有证据表明这两种途径是相互联系的，一种途径中的分子可以影响另一种途径。

 

内源性细胞凋亡途径

内源性细胞凋亡是由不同的细胞内应激信号触发的，它导致caspase依赖或caspase独立的细胞死亡级联。Caspases是一个半胱氨酸蛋白酶家族，其功能与细胞凋亡有关。当促死亡信号超过促生存信号时，就会触发细胞凋亡。细胞凋亡的途径有三个关键步骤：诱导阶段，各种信号触发信号转导途径。效应器阶段，多种刺激介导的途径汇聚在一起并发出细胞死亡的信号。降解阶段，细胞结构遭到破坏。一旦平衡被打破，细胞就会激活上游启动器caspase-8（CASP8）或caspase-9。这些caspases裂解并激活执行者caspase-3和caspase-7。执行者caspases裂解数以百计的细胞目标，导致生化和形态学特征的改变，最终导致细胞死亡。

Caspase依赖性内源性细胞凋亡的效应阶段涉及到压力信号介导的促凋亡Bcl-2（B细胞淋巴瘤2）家族蛋白之一，如Bak或Bax之间的结合。被激活的Bak和Bax低聚物诱发孔的形成和线粒体外膜透化（MOMP）。在MOMP之后，细胞色素c从线粒体中释放出来，并与一个支架蛋白APAF1（凋亡蛋白酶激活因子1）结合，形成细胞凋亡体。这一事件导致caspase-9前体的激活及其随后的裂解和caspase-3的激活，导致一系列细胞底物的降解，最后导致细胞死亡。

 

外源性细胞凋亡途径

外源性细胞凋亡是由质膜受体检测到的细胞外微环境的干扰启动的，由CASP8传播。这一途径是由两种类型的质膜受体中的任何一种驱动的： (1）死亡受体（DR），其激活取决于特定配体的结合；（2）依赖性受体，当其特定配体的水平下降到特定阈值以下时，其激活就会发生。死亡受体包括Fas细胞表面死亡受体CD95或APO-1。死亡受体的信号传导也可以导致NF-κB的激活，一般会导致与强大的炎症反应相关的细胞存活。

 

检测早期和晚期凋亡的方法

诱导细胞凋亡导致细胞表面的“吃我”信号在细胞裂解的后期凋亡事件之前暴露。质膜细胞外表面的磷脂酰丝氨酸（PS）残基的暴露，已被确定为早期凋亡的一个早期标志。磷脂结合蛋白，如Annexin V，在有Ca²⁺的情况下与PS高度亲和。鉴于Annexin V不具有细胞渗透性，其与外翻PS的结合对早期凋亡细胞是有选择性的。考虑到Annexin V通常与荧光素（FITC）结合，在绿色荧光蛋白（GFP）表达的细胞中检测凋亡可能是有问题的。这两种荧光团的发射谱线重叠，使得区分信号很困难。GFP CERTIFIED® Apoptosis/Necrosis Detection Kit（ENZ-51002，EnzoLife）专门设计用于表达GFP的细胞系和表达蓝色或青色荧光蛋白的细胞。该试剂盒包括测定细胞凋亡早期和晚期以及坏死的所有必要试剂。试剂盒中的Cy3偶联物-Annexin V-EnzoGold (enhanced Cyanine 3) conjugate（ENZ-51002，EnzoLife）能检测不同于荧光素或GFP的细胞凋亡。坏死检测试剂是一种红色的染料，有利于晚期细胞凋亡和坏死的检测。

图1：区分健康、早期和晚期的凋亡和坏死细胞，与绿色荧光探针兼容。GFP CERTIFIED® Apoptosis/Necrosis Detection Kit（ENZ-51002，EnzoLife）。

 

细胞色素c释放试验

在细胞凋亡过程中，细胞色素c从线粒体释放到细胞膜上，随后激活caspases。这使得细胞色素c的释放成为用于检测细胞凋亡的几个关键特征之一。一些基于酶联免疫吸附enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)的方法可用于测量细胞培养上清液、完整细胞、亚细胞组分、组织提取物或体液中的细胞死亡相关参数。我们的Cytochrome c (human) ELISA kit（ADI-900-141，EnzoLife）已经过验证和优化，可以定量测定细胞色素c在细胞膜和线粒体细胞组分中的含量，并提供细胞组分缓冲液。

图2：一个典型的标准曲线。Cytochrome c (human) ELISA kit（ADI-900-141，EnzoLife）

 

“彗星”分析法

细胞凋亡的标志包括细胞皱缩、膜起泡、核凝结和DNA断裂。Comet SCGE assay kit（ADI-900-166，EnzoLife）是一种快速而简单的电泳方法，用于检测细胞凋亡。该方法通过荧光检测在嵌入低熔点琼脂糖的细胞中释放出来的DNA的完整性来测量DNA损伤。电泳时，凋亡细胞的DNA碎片会产生一个特有的“彗星（Comet）”形尾巴，因为小的DNA碎片在凝胶中的迁移速度比完整的基因组DNA更快。细胞DNA尾巴的长度与细胞凋亡的程度有关。

图3：用100 mM过氧化氢在4℃处理CaSki细胞20分钟。进行Comet SCGE检测，并使用FITC过滤器对玻片进行成像。Comet SCGE assay kit（ADI-900-166，EnzoLife）

 

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶测定

在细胞凋亡过程中，各种caspase被激活，而这些caspase又会裂解细胞内的其他蛋白，从而激活细胞凋亡。Caspase测定法被用来区分早期或晚期的细胞凋亡。例如，Caspase 3 cell assay kit（BML-AK703，EnzoLife）可通过检测Caspase-3和caspase-3类似物（细胞DEVDase）活性来确认细胞提取物中的凋亡情况，这是凋亡细胞中发现的主要caspase活性之一。Caspase-3是白介素-1转换酶（ICE）家族中的一个半胱氨酸蛋白酶的成员。在凋亡信号事件中，caspase-3被上游蛋白酶激活，包括caspase-6、caspase-8和细胞毒性T细胞衍生的颗粒酶B。Caspase-3裂解的目标物包括多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）、核蛋白、凝溶胶蛋白和其他。

细胞提取物和纯化的caspase-3对DEVD-pNA的裂解。Caspase 3 cell assay kit（BML-AK703，EnzoLife）

 

化学发光细胞活力测定

凋亡细胞的ATP水平明显下降，细胞中ATP水平的下降是细胞死亡的指标。相反，细胞增殖则表现为ATP水平的升高。ApoSENSOR™ Cell Viability assay kit（ALX-850-247，EnzoLife） 利用生物发光法检测ATP水平，可同时快速筛查哺乳动物细胞的凋亡和增殖。该试剂盒利用荧光素酶催化ATP和荧光素而化学发光，同时可使用发光仪测量。

图5  ApoSENSOR™ Cell Viability assay kitApoSENSOR™ Cell Viability assay kit（ALX-850-247-KI01，EnzoLife） 可有效检测细胞凋亡。喜树碱诱导Jurkat细胞凋亡并分析其ATP水平。时间曲线显示喜树碱诱导细胞凋亡后ATP水平的下降。ATP水平的下降与Annexin V阳性染色细胞的增加负相关。

 

染色体缩合

另一种检测细胞凋亡的方法是评估细胞凋亡过程中发生的染色体缩合。在细胞凋亡过程中，染色体会经历不同阶段的缩合。NUCLEAR-ID® Green chromatin condensation detection kit（ENZ-51021-K200，EnzoLife）可用于荧光显微镜、流式细胞仪和微孔板检测。细胞渗透性DNA染色染料在染色体缩合时发出更亮的荧光，将细胞核缩合的凋亡细胞与正常细胞区分开来。

图6：使用标准488 nm激光在荧光显微镜下观察染色质凝聚。在载玻片上用DMSO（对照组）或2 µM 星形胞菌素处理HeLa细胞4小时，并用5 µM NUCLEAR-ID® Green染料染色。染料在染色质缩合时荧光增强，染色质缩合是细胞凋亡的标志。 NUCLEAR-ID® Green chromatin condensation detection kit （ENZ-51021-K200，EnzoLife）

 

线粒体膜电位丧失测量

细胞凋亡的生化标志包括线粒体膜电位的丧失。研究发现，药物在线粒体内蓄积引起的膜电位受损会导致多种器官中毒，尤其是心脏和肝脏。MITO-ID® Membrane Potential Cytotoxicity Kit （ENZ-51019-KP002，EnzoLife）使用阳离子染料测量线粒体膜电位，该染料可根据线粒体膜电位状态发出绿色或橙色荧光。在活细胞中，MITO-ID®膜电位染料以绿色荧光单体形式存在于细胞膜中，并以橙色荧光聚集体形式在线粒体中聚集。然而，在线粒体膜电位受损的细胞中，MITO-ID®膜电位染料主要以绿色荧光单体形式存在于整个细胞质中，在线粒体中不再显示橙色荧光。

图7：MITO-ID® 膜电位测量。检测线粒体扰动的灵敏度是JC-1的10倍。使用MITO-ID®染料（红色）或JC-1（蓝色）评估经CCCP处理的HeLa细胞的线粒体膜电位（MMP）。使用传统的荧光微孔板阅读器，MMP随着CCCP浓度的增加而降低，表现为橙色荧光的减少。改进的染料水溶性和免洗方案最大程度地减少了变异性，从而获得了比JC-1更高的Z因子（> 0.9）。MITO-ID® Membrane Potential Cytotoxicity Kit（ENZ-51019-KP002，EnzoLife）

 

文中部分相关产品：

货号	产品名	相关应用	规格
ENZ-51002-25	GFP-CERTIFIED® Apoptosis/Necrosis detection kit	区分健康，早期凋亡，晚期凋亡和坏死细胞，可与GFP和其他蓝色/青色荧光探针一起使用。适用于死亡途径分析和药物/毒素研究，可用于活细胞或固定细胞	25 assays
ENZ-51002-100			100 assays
ENZ-51019-KP002	MITO-ID® Membrane potential cytotoxicity kit	适用于评估完整和受损线粒体的时程研究；单独的MITO-ID®测定可用于检测线粒体质量；适用于高通量应用	1 Kit
ENZ-51021-K200	NUCLEAR-ID® Green chromatin condensation detection kit	评估细胞凋亡过程中发生的染色体缩合；用于荧光显微镜、流式细胞仪和微孔板检测	1 Kit
ADI-900-141	Cytochrome c (human) ELISA kit	可以定量测定细胞色素c在细胞膜和线粒体细胞组分中的含量，并提供细胞组分缓冲液	96 wells
ADI-900-166	Comet SCGE assay kit	一种快速简便的电泳方法，用于检测和定量细胞中与DNA损伤和凋亡相关的DNA片段	50 tests
BML-AK703-0001	Caspase-3 cell assay kit	用于检测细胞提取物中的caspase-3和caspase-3类似物的活性（DEVDase）；Caspase-3酶可作为阳性对照，用于检测细胞提取物中的内源性抑制剂	96 wells
ALX-850-247-KI01	ApoSENSOR™ Cell viability assay kit	利用生物发光法检测ATP水平，可同时快速筛查哺乳动物细胞的凋亡和增殖	200 tests

 

关于Enzo Life

Enzo Life做为分子诊断领域的先驱者，可提供包括基因、蛋白、细胞、组织全层面的标记和检测试剂，如原位杂交探针、活细胞荧光探针、组化试剂盒、小分子化学文库等。除了科研领域外，Enzo Life还给提供多样的生物工艺质量检测试剂盒（如Protein A残留检测盒，HCP残留检测等 ）