如何检测细胞活力与细胞毒性？

Ross Granville Harrison成功地在体外培养出动物组织，并在他的文章中介绍了组织培养的主要原理，描述了培养神经细胞和监测纤维发育的方法（1）。由于目前可用的条件、技术和培养基多种多样，我们几乎可以在体外培养和操作每一种细胞。从“经典”细胞生物学方法到基因工程，从生产重组蛋白、抗体和疫苗到癌症研究，细胞培养因其多种应用而成为一种基础工具。

当然，这些技术的发展是与操作模型和研究其反应所需工具的引入同步进行的。特别是在治疗领域，分析细胞活力、毒性和死亡机制的可能性是确定潜在治疗方法的关键因素。根据细胞类型、首选的检测方法、特定的实验条件和确切的目标，可以研究不同的参数。

 

细胞活力检测

这些测试可用于评估最合适的细胞培养条件或分析特定处理/程序对培养细胞健康的影响。它们可以基于反映存活细胞数量的不同因素进行评估。由于读出的是活细胞数，一些检测方法可用于细胞增殖分析。以下将简要介绍用于细胞活力研究的最典型指标。

代谢活性。这可能是了解细胞是否存活和状态是否良好的最直观参数。它可以从不同角度进行研究。

线粒体是真核细胞新陈代谢的核心。它们是细胞呼吸的总部，通过一系列复杂的酶促反应最终产生ATP，同时将O₂分子还原为H₂O。线粒体活性与细胞活力密切相关，因此耗氧率（oxygen consumption rate, OCR）是新陈代谢活跃的良好指标：不健康的细胞往往线粒体功能失调，因此耗氧率较低。最易获得的OCR评估策略之一是使用磷光水溶性氧探针，通过改变其发射强度来响应溶解氧浓度的变化（2）。更具体地说，一些荧光团的荧光被分子氧淬灭：氧气浓度越低，检测到的信号越高。在这些检测中，通常使用一滴矿物油来密封每个样品，以避免大气中氧气的反向扩散（2，3）。该系统的优点是可直接提供细胞代谢率和线粒体活性的信息，并可直接用于高通量筛选分析。然而，它对培养条件（如温度和细胞密度）的相对微小变化极为敏感，必须严格控制以获得可重复的结果。

通过线粒体活性评估细胞活力的另一种方法是量化培养物中的ATP，因为ATP水平与活细胞数量相关。这通常通过测量ATP在荧光素酶催化下与荧光素反应释放的生物荧光来实现（图1）。

 

图1 荧光素酶利用ATP氧化氧荧光素中的荧光素，从而产生光。

 

Enzo的ApoSENSOR™ Cell viability assay kit（ALX-850-247-KI01，EnzoLife）利用了这一原理，检测简单灵敏（可检测10-100个哺乳动物细胞/孔），可进行自动化高通量分析。根据实验设计，该试剂盒可用于细胞增殖和细胞毒性研究。

一组经典的细胞活力检测方法，同样与只在活细胞中起作用的酶有关，是基于细胞脱氢酶还原四氮唑盐（如MTT、XTT、WST-1、WST-8）。反应将形成彩色的甲臢产物，可用分光光度法定量。有色产物的强度与培养物中活细胞的数量成正比。

MTT四氮唑还原测定是第一个为96孔板开发的均相细胞活力测定（4），目前仍在广泛使用。然而，该方法在读取吸光度之前需要一个额外的步骤来溶解甲臢，而且MTT本身对细胞也有毒性。Enzo的Cell Counting Kit-8（CCK-8）（ALX-850-039，EnzoLife）的主要成分WST-8四氮唑盐（5）克服了这些缺点。WST-8还原产生一种水溶性的甲臢产物，无需溶解步骤。此外，它比其他四氮唑盐更灵敏（图2），且毒性更低。检测完成后，相同的细胞可用于其他细胞增殖检测。

 

图2 使用WST-8（CCK-8）和其他四氮唑盐进行细胞增殖试验（贴壁和悬浮细胞模型）。

 

此外，在这种情况下，试剂盒通常不仅用于评估细胞活力，还用于细胞增殖研究。例如，在最近的几篇研究文章中，该试剂盒被用于测量接种在新生物材料上细胞的增殖情况，这在再生医学中具有潜在的应用价值（6，7）。

膜渗透性：染料包被/排斥。细胞膜（如质膜、核膜等）在细胞生物学中起着重要作用。它们的完整性对细胞的正常功能不可或缺，是监测细胞活力的良好标志。

包合染料可在细胞内被动扩散，一旦被某些细胞酶家族裂解，就会被 “卡住”。一个典型的例子是钙黄绿素引入乙酰甲氧基甲酯（AM）：一旦进入细胞，酯酶就会裂解AM基团，此时亲水性更强的钙黄绿素就无法通过质膜，从而被困在细胞内。失去AM基团还可使钙黄绿素与细胞内的钙结合，从而容易发出荧光。由于死细胞缺乏酯酶，因此只有活细胞才会发出荧光。Counting Kit-F（ALX-850-245，EnzoLife）正是基于这一原理，提供比比色法更灵敏的活力/增殖检测，检测范围从约50个细胞到至少25000个细胞。

排斥染料是一种荧光分子，只有当细胞质膜不完整时，即当细胞死亡时，才能进入细胞并在细胞内积聚。这类分子的典型例子是两种DNA插层染料： 碘化丙啶（PI）和7-氨基放线菌素D（7-AAD）。排斥染料可与其它荧光探针结合使用，以获得有关细胞状态的更详细信息，或对死亡机制进行更精细的分析。

NUCLEAR-ID® cell viability reagents （Blue/Green（ENZ-53004-C100，EnzoLife）, Blue/Red（ENZ-53005-C100，EnzoLife）, Red/Green（ENZ-53006-C100，EnzoLife））都含有一种细胞可渗透性核酸染料（适用于染色活细胞）和一种细胞不可渗透性核酸染料（适用于染色死细胞）的混合物，具有不同的荧光发射光谱。这两种染料同时结合产生的染色模式可确定被测样品中的活细胞群和死细胞群。值得一提的是，尽管这些试剂盒通常在2D细胞单层中进行验证，但我们也有其与3D细胞模型兼容的实例。例如，Enzo Life曾经使用NUCLEAR-ID® blue/red cell viability reagent (GFP-CERTIFIED®)（ENZ-53005-C100，EnzoLife）这个试剂盒应用于人 iPSC 衍生的三维肝细胞模型和神经球模型的毒性研究。

最后，处于早期凋亡阶段的细胞保持其膜的完整性，不会被排斥染料染色。因此，这些染料可与细胞凋亡特异性标记物（即与荧光团连接的Annexin V）结合使用，以区分活细胞（未标记）、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和坏死细胞。相关内容请查阅“检测细胞凋亡关键特征的七大法宝”。

 

细胞毒性检测

细胞毒性测定代表了细胞活性的另一面，因为它们侧重于检测和量化特定条件下的细胞损伤，它们的工作原理通常与细胞膜损伤有关。

线粒体活动：如前所述，线粒体利用膜电位梯度产生的能量产生ATP。线粒体膜电位（MMP）的丧失与线粒体通透性转换孔的打开有关，导致细胞色素C释放到细胞质中，引发其他下游事件，最终导致细胞凋亡。MMP崩解检测是检测细胞毒性事件早期阶段的关键。Rhod123、DiOC6和JC-1等几种亲脂性荧光阳离子染料可用于这种情况。作为带正电荷的分子，这些染料会根据膜电位在线粒体内积聚：健康的超极化线粒体（基质带负电荷较多）会积聚较多的阳离子染料，而去极化线粒体（基质有害性较小）则积聚较少的染料（8）。因此，特定处理的细胞毒性效应可通过阳离子染料相关荧光强度的降低来测量。这就是Enzo的MITO-ID® Membrane potential cytotoxicity kit（ENZ-51019-KP002，EnzoLife）工作原理，该试剂盒含有双发射染料。MITO-ID®探针在功能线粒体中聚集成橙色荧光聚集体，在细胞质中聚集成绿色荧光单体。当线粒体功能日益受损时，橙色荧光会下降。该试剂盒可进行实时MMP检测，其灵敏度优于同类染料（如比JC-1高10倍，图3）。

图3 使用MITO-ID®染料（红色）或JC-1（蓝色）评估经CCCP处理的HeLa细胞中的MMP。MMP随CCCP浓度的增加而降低，如橙色荧光的降低所示。改进的染料水溶性和免洗方案最大程度地减少了变异性，从而获得了比使用JC-1更高的Z因子（> 0.9）。

 

该试剂盒可用于研究线粒体在药物毒性和细胞死亡过程中的作用。例如，为了更好地表征癌细胞的程序性细胞死亡（除凋亡外）机制，Thi Le及其合作者成功地利用该试剂盒阐明了p53在饥饿诱导的HCT116结肠癌细胞坏死中的作用（9）。

酶泄漏检测：由于细胞死亡导致质膜完整性丧失，通常被限制在细胞内的酶不可逆转地泄漏到细胞外空间。因此，检测这些“逃逸”酶的活性是细胞毒性的一个明显标志。在这种情况下，检测乳酸脱氢酶活性（LDH）是最流行的解决方案之一。LDH是一种稳定的细胞质酶，在所有参与糖酵解过程的细胞中均有表达。由于细胞凋亡、坏死或其他形式的细胞损伤导致细胞膜完整性丧失，LDH被释放到细胞培养基中（10）。

在典型的检测过程中，LDH催化乳酸转化为丙酮酸，将NAD+还原为NADH。后者反过来将四氮唑盐还原成水溶性的甲臢染料，甲臢染料的量与LDH的总活性成正比，从而与受损细胞的数量成正比（10）。与CCK-8试剂盒类似，Enzo的LDH Cytotoxicity WST assay（ENZ-KIT157，EnzoLife）使用水溶性四氮唑盐（WST）作为底物（图4）。

 

图4 LDH相关细胞毒性测量原理。

 

这两种试剂盒可视为两种互补的检测方法，它们的组合可在给定的实验条件下对细胞健康状况进行全面评估（图5）。

图5 Cell Counting Kit-8（ALX-850-039，EnzoLife）和LDH Cytotoxicity WST Assay（ENZ-KIT157，EnzoLife）提供了补充信息。

 

说到细胞毒性检测，药物诱导毒性筛选是我们能想到的最直接的例子，尽管这只是潜在应用之一。例如，几个月前，韩国的一个研究小组使用LDH Cytotoxicity WST（ENZ-KIT15，EnzoLife）检测幽门螺旋杆菌感染后THP-1细胞的细胞毒性，研究重点是查尔酮衍生物对NLRP3炎性体激活的保护作用（11）。

 

文中部分相关产品：

货号	产品名	相关应用	规格
ALX-850-247-KI01	ApoSENSOR™ Cell viability assay kit	该检测法利用生物发光检测 ATP 水平，可同时快速筛查哺乳动物细胞的凋亡和细胞增殖。	200 tests
ALX-850-039-KI02	Cell Counting Kit-8	一种比色检测试剂盒，用于检测细胞增殖和细胞毒性。	5x500 tests
ALX-850-039-KI01			500 tests
ALX-850-039-0100			100 tests
ALX-850-245-KI02	Cell Counting Kit-F	荧光测定试剂盒，用于简单、准确的细胞增殖和细胞毒性检测。	5x500 tests
ALX-850-245-KI01			500 tests
ENZ-53004-C100	NUCLEAR-ID® Blue/Green cell viability reagent	适用于染色死细胞核。	100 µl
ENZ-53005-C100	NUCLEAR-ID® Blue/Red cell viability reagent (GFP-CERTIFIED®)		100 µl
ENZ-53006-C100	NUCLEAR-ID® Red/Green cell viability reagent		100 µl
ENZ-51019-KP002	MITO-ID® Membrane potential cytotoxicity kit	利用阳离子双发射染料测量线粒体膜电位（MMP）的波动，是一种独特的 HTS 检测方法，可实时监测线粒体膜电位，无需洗涤或移除培养基。	1 Kit
ENZ-KIT157-2500	LDH Cytotoxicity WST Assay	一种比色检测试剂盒，用于通过检测受损细胞释放的乳酸脱氢酶活性来确定细胞毒性。	5x500 tests
ENZ-KIT157-0500			500 tests

 

关于Enzo Life

Enzo Life做为分子诊断领域的先驱者，可提供包括基因、蛋白、细胞、组织全层面的标记和检测试剂，如原位杂交探针、活细胞荧光探针、组化试剂盒、小分子化学文库等。除了科研领域外，Enzo Life还给提供多样的生物工艺质量检测试剂盒（如Protein A残留检测盒，HCP残留检测等 ）

References:

1.Harrison R. Observations on the living developing nerve fiber. Anat. Rec. (1907).

2.Hynes J et al. Fluorescence-based cell viability screening assays using water-soluble oxygen probes. J. Biomol. Screen. (2003).

3.Hynes J et al. The use of a fluorescence-based oxygen uptake assay in the analysis of cytotoxicity. Toxicol. In Vitro (2006).

4.Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Meth. (1983).

5.Tominaga H et al. A water-soluble tetrazolium salt useful for colorimetric cell viability assay. Analyst. Comm. (1999).

6.Liu H et al. A simultaneous grafting/vinyl polymerization process generates a polycationic surface for enhanced antibacterial activity of bacterial cellulose. Int. J. Biol. Macromol. (2020).

7.Choi JB et al. Fabrication and Characterization of Biodegradable Gelatin Methacrylate/Biphasic Calcium Phosphate Composite Hydrogel for Bone Tissue Engineering. Nanomaterials (2021).

8.Perry SW et al. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. Biotechniques (2011).

9.Thi Le DD et al. Inhibitory role of AMP‑activated protein kinase in necroptosis of HCT116 colon cancer cells with p53 null mutation under nutrient starvation. Int. J. Oncol. (2019).

10.Kamiloglu S et al. Guidelines for cell viability assays. Food Frontiers (2020).

11.Choi HR et al. Interruption of Helicobacter pylori-induced NLRP3 Inflammasome Activation by Chalcone. Biomol. Ther. (2021).