类器官HE染色、免疫组化、免疫荧光鉴定方法

类器官HE染色、免疫组化、免疫荧光鉴定方法
我们辛辛苦苦养好的类器官，该如何做鉴定呢？通常是HE染色、免疫组化或免疫荧光。今天小爱带大家了解一下具体的染色步骤。
HE染色实验步骤

一、类器官收集

1、  类器官收集（例如24孔板，收集6-8孔类器官，大约1000-2000个类器官）
移液器吸去培养基，每孔添加 1-2ml 左右，移液抢轻柔吹打基质胶，收集在 15ml 离心管中，4℃静置 10min。300g 4℃ 离心 5min 弃去上清。

2、  类器官清洗
加入1ml PBS重悬移入 1.5ml 离心管，300g 4℃ 离心 5min弃去液体。

二、类器官固定

1、PFA固定
加入1ml 4%多聚甲醛(abs9179)至EP管，轻柔吹打混匀，至于4℃固定1h（最长不超过10h）。固定结束后，300g 4℃ 离心 5min 弃去上清。

2、  类器官清洗
加入1ml PBS重悬移入 1.5ml 离心管，300g 4℃ 离心 5min弃去液体。

三、类器官琼脂糖包埋

1、称量0.2至0.4g琼脂糖，加入至烧杯或者小试剂瓶内，加入10mL左右PBS。微波炉高火融化，每隔5s暂停打开，观察，重复数次至琼脂糖融化完全。

2、待琼脂糖溶液降温至50-60℃，取20-50uL融化琼脂糖溶液，加入至1.5ml EP管重悬类器官沉淀，冰上放30min，待其凝固。

四、类器官石蜡包埋

1、脱水：取出已凝固的含有类器官沉淀的琼脂糖块，在梯度乙醇中脱水，70%、80%、90%和95%乙醇各1h，100%乙醇30min，待其凝固；

2、融蜡：提前4h左右打开烘箱，65℃溶蜡；

3、透明：将脱水完成后的琼脂糖块转移至组织包埋盒中（二甲苯处理前需一直浸泡在无水乙醇中），将包埋盒转移至二甲苯中5min处理两次；注：因二甲苯有毒性，需在通风良好区域进行操作，取出时尽量沥尽残留二甲苯。

4、浸蜡：透明化处理完成后立即转入已经融化的蜡缸中，60℃浸蜡2h后，更换新的蜡缸再次浸蜡2h；

5、包埋：包埋在冰盒上进行，将融好的纯蜡倒入蜡盒三分之一处，将琼脂块放置于中间位置，然后再滴蜡包埋直到倒满。待蜡块完全凝固后，小心脱下模具。

 

 

6、切片：将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成薄片，一般是5-8um厚，并用小镊子将包含有完整组织的切片置于40°C温水中。

7、捞组织：组织受热展开，最好是组织不起皱纹，用载玻片捞组织时，一般取载玻片的下1/3或者下1/2，一般每种组织捞5-6张，其中2-3张是备用的，每张载玻片上通常捞两份组织，做对照使用，这样形成的误差就比较小了，而且捞载玻片的时候最好方向一致，以便观察，再将捞出来的载玻片置于架子上，放入37°C温箱中烘干。

五、类器官HE染色

1、脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯I 10min；二甲苯Ⅱ10min；无水乙醇Ⅰ5min；无水乙醇Ⅱ5min；95%酒精5min；90%酒精5min；80%酒精5min；70%酒精5min；蒸馏水洗。

2、苏木素染细胞核：切片入Harris苏木素染3-8min，自来水洗。

3、伊红染细胞质：切片入伊红染液中染色1-3min，自来水洗。

4、脱水封片：将切片依次放入95%酒精I 5min ；95%酒精II 5min；无水乙醇Ⅰ5min ；无水乙醇Ⅱ5min ；二甲苯Ⅰ5min ；二甲苯Ⅱ5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。

5、显微镜镜检，图像采集分析

 

 

六、类器官鉴定-HE染色结果（以肺癌为例）

 

免疫组化实验步骤
将HE染色步骤里脱蜡后的切片进行如下处理：
1. 抗原修复：加入3%H2O2浸泡10min，从而除去内源性的过氧化氢酶，然后倒掉H2O2，在清水中洗两次，再加入柠檬酸缓冲液，放入微波炉中蒸煮3min（中火），一般刚到沸腾即可，冷却至室温，然后再蒸煮一次，冷却至室温，蒸煮的目的是为了使抗原的位点暴露出来。
2. 血清封闭：冷却至室温后，将柠檬酸缓冲液倒掉，水洗2次，并将载玻片置于PBS中5min，洗2次，擦干组织周围的PBS液，马上加上血清，使一些非特异 性的位点封闭起来，然后放入37°C温箱中半小时。血清稀释10倍（900µlPBS：100µl血清封闭液）。
3. 加一抗：将温箱中的载玻片取出，用吸水纸擦干载玻片反面和正面组织周围的血清，加一抗，如果做对照实验，就在对照的组织上加PBS。加完一抗后于4°C冰箱中保存过夜。
4. 加二抗：将载玻片从冰箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上二抗，然后置于37°C温箱中半小时。
5. 加SABC: 将片子从温箱中取出,，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上SABC, 然后置于37°C温箱中半小时。SABC稀释100倍（990µlPBS：10µlSABC）。
6. 加显色剂：将片子从温箱中取出, 放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上显色剂。（显色剂的配置：在1ml水中加1滴显色剂A，摇匀，然后加1滴显色剂B，摇匀， 再加1滴显色剂C，摇匀，A：DAB， B：H2O2，C：磷酸缓冲液）
7. 复染：将显色后的片子用清水冲洗一段时间后，浸泡于苏木精中染色半分钟。
8. 脱水：将复染后的片子置于水中冲洗后，依次将载玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。每个试剂中放置2min，最后浸泡在二甲苯中，搬到通风柜中。
9. 封片：用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上，要先放平一侧，然后轻轻放下另一侧，以免产生气泡，封好片子后置于通风柜中晾干。

 

免疫荧光实验步骤
将免疫组化步骤里一抗孵育后的切片进行如下处理：
1. 加荧光二抗：PBS浸洗3次，每次3 min，吸干切片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中37℃孵育1h，PBS浸洗3次；注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量避光操作；
2. 复染核：滴加DAPI避光孵育5 min，对标本进行染核，用PBS清洗4次，洗去多余的DAPI；
3. 封片：防荧光淬灭封片剂封片、荧光显微镜观察。

 

本期小爱推荐

货号	品名	规格
abs44056210	琼脂糖	100g
abs42155596	石蜡	500g
abs962	1×PBS缓冲液	500ml/500ml*10
abs9222	伊红染液	100ml
abs9214	苏木素染液	100ml /500ml
abs9177	中性树胶	100ml/ 100ml×10
abs7119	1.5ml离心管（无菌无酶）	1袋/1箱
abs7118	0.5ml离心管（无菌无酶）	1袋/1箱
abs9444	Organotial人肝癌类器官培养基试剂盒	1kit
abs9445	Organotial人结直肠癌类器官培养基试剂盒	1kit
abs9443	Organotial人肺癌类器官培养基试剂盒	1kit
abs9449	Organotial人胃癌类器官培养基试剂盒	1kit
abs9447	Organotial人胰腺癌类器官培养基试剂盒	1kit
abs9589	Organotial人鼻咽癌类器官培养基试剂盒	1kit
abs9446	Organotial人乳腺癌类器官培养基试剂盒	1kit
abs9558	Organotial人卵巢癌类器官培养基试剂盒	1kit
abs9590	Organotial人宫颈癌类器官培养基试剂盒	1kit
abs9448	Organotial人子宫内膜癌类器官培养基试剂盒	1kit
abs9739	Organotial人脑胶质瘤类器官培养基试剂盒	1kit