如何分辨细胞死亡类型

细胞死亡是发育、平衡和宿主防御的一个重要生物过程。在过去十年中，许多新型细胞死亡模式已被定义和表征。细胞死亡可分为调节性细胞死亡（Regulated cell death, RCD）和意外细胞死亡（Accidental cell death, ACD）。调节性细胞死亡涉及基因编码机制，这些机制在细胞外或细胞内信号的触发下，以协调的事件序列发挥作用。这些信号可以通过药物干预进行靶向调节。生理形式的 RCD 泛指程序性细胞死亡（Programmed cell death, PCD）。

调节性细胞死亡曾是细胞凋亡的代名词，但现在人们认识到，调节性细胞死亡还包括许多其他新发现的程序性细胞死亡途径。最近发现了几种调节性细胞死亡类型，它们具有共同的形态特征，但采用了不同的分子途径。其中包括坏死（Necroptosis）、细胞焦亡（Pyroptosis）。因为这些途径在不同的触发因素下被激活，并通过不同的生化途径执行，所以区分不同形式的非凋亡性细胞死亡具有挑战性。

坏死

细胞坏死是由坏死体复合物的形成引起的一种细胞坏死，与细胞凋亡不同，它是一种不依赖于caspase的细胞死亡形式。细胞坏死是由上游细胞死亡受体（DRs）诱导的，如肿瘤坏死因子 TNF 受体 1（TNFR1）（ADI-CSA-815，EnzoLife）、CD95、TRAIL-R1 （ALX-804-912-0100，EnzoLife）和 TRAIL-R2（ALX-210-743-C200，EnzoLife）的超家族受体，它们能在配体结合后通过一个保守的细胞膜死亡结构域传递细胞死亡信号。坏死的标志是质膜破裂并释放促炎性损伤相关分子模式。通过化学抑制或转基因模型来靶向坏死通路的成分，可用于确认细胞死亡是否依赖于坏死。Necrostatin-1 (Nec1) （BML-AP309，EnzoLife）可抑制细胞坏死。病毒编码几种不同类型的 caspase-8 抑制剂，这表明阻止 caspase-8 依赖性细胞凋亡为病毒提供了优势。在这种情况下，细胞坏死似乎是限制病毒复制的后备细胞死亡过程。

细胞焦亡

细胞焦亡是一种调节性坏死细胞死亡，主要发生在单核细胞和巨噬细胞中。这种形式的RCD由炎性 caspase（即小鼠的 caspase-1 和 Caspase-11（BML-SE155-5000，EnzoLife），或人的 Caspase-4 （BML-SE176-5000，EnzoLife）和 Caspase-5（BML-SE171-5000，EnzoLife））诱导。caspase-1和caspase-11（或caspase-4、-5）都会通过蛋白分解处理Gasdermin D（GSDMD）产生一个N端片段，从而诱导细胞焦亡，打开质膜上的孔，导致细胞死亡。释放的蛋白质包括先天性细胞因子 IL-1β 和 IL-18，它们与其他细胞蛋白质一起导致组织炎症。热蛋白沉积通常发生在微生物感染之后，其作用是启动免疫反应并杀死受感染的细胞。发生热蛋白沉积的细胞会出现与 DNA 损伤相关的核凝结、细胞肿胀，并最终在释放 IL-1β 的同时发生细胞溶解。造成这一过程的机制涉及细胞内细菌产物传感器和炎性体的形成。炎性体基因表达的增加可能是细胞内促炎症反应的迹象。可以通过观察Caspase活化、GSDMA 裂解，或通过抑制或消减细胞焦亡途径的关键成分来研究细胞焦亡。可通过释放的 LDH 定量、荧光显微镜观察膜完整性的丧失以及检测 IL-1b 来评估裂解。在裂解过程中，活性 Caspase会从其无活性的Caspase前体形式中裂解出来。使用特异性caspase抗体可通过 Western Blot检测Caspase的裂解。证明Caspase 1、11、4 或 5 的依赖对于区分细胞焦亡导致的细胞死亡与其他形式的坏死和凋亡至关重要。使用Pan Caspase抑制剂Z-VAD-FMK（ALX-260-020，EnzoLife）进行化学抑制，可以消除Caspase 1的活性。

铁死亡

铁死亡是一种受调控的细胞死亡形式，是铁依赖性活性氧（ROS）积累导致的致命脂质过氧化反应的结果。有多种方法可用于检测 ROS（ENZ-51011，EnzoLife） 的存在。铁死亡的细胞通常表现为细胞膜破裂和细胞内容物的释放。谷胱甘肽过氧化物酶 4（GPX4）是一种能还原过氧化氢、有机氢过氧化物和过氧化脂质的酶，它的丧失或活性降低也会引发铁死亡。在GPX4缺乏的情况下，脂质过氧化会通过脂质自由基（脂质过氧自由基）的积累而失控。脂质过氧化改变了脂质的化学性质，降低了它们形成功能性细胞膜的能力，因此会导致膜完整性丧失和细胞死亡。脂质烷氧基自由基的碎裂还会产生丙二醛4-羟基壬烯醛4-hydroxynonenal (4-HNE)（BML-HA004，EnzoLife）等活性醛。通过铁螯合剂、亲油抗氧化剂、脂质过氧化抑制剂和多不饱和脂肪酸的消耗，可抑制细胞的铁死亡，这与脂质过氧化标记物的积累有关。通过观察抑制剂是否能阻止细胞死亡以及测量脂质过氧化物lipid peroxides（BML-AK171，EnzoLife），可以确认是否存在铁死亡。研究铁死亡的有效方法包括测量谷胱甘肽过氧化物酶的活性。

图 1：用 100 μM 的焦花青素（一般 ROS 诱导剂，A 组）或 1 μM 的叔丁基过氧化氢（过氧化物诱导剂，B 组）诱导 Jurkat 细胞，用ROS-ID® Total ROS Detection Kit（ENZ-51011，EnzoLife）染色，并用流式细胞仪进行分析。未经处理的细胞作为对照。

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