类器官crispr-cas9基因编辑及慢病毒转染实验方法

近几年，类器官研究十分火热，在信号通路机制，药筛药敏等研究中对类器官模型需求激增，其中利用 crispr-cas9基因编辑技术对类器官进行敲低或敲减来造模是个不错的实验方法，今天小爱带大家来了解 crispr-cas9基因编辑技术及慢病毒转染方法。

 crispr基因编辑技术中有三个最为重要的组成部分：crRNA、sgRNA和Cas9蛋白。crRNA与Cas9蛋白形成复合物，sgRNA指引（crRNA/cas9）复合物靶向目的DNA区域定向切割DNA，从而达到基因编辑的目的。

 

图1.  crispr-cas9基因编辑技术示意图

 

 crispr-cas9基因编辑技术大体上有三种技术路线：All in one质粒转染法，病毒转化法，RNP复合物导入法。病毒转化法是将sgRNA、crRNA和表达cas9蛋白的序列整合进病毒中，再使用病毒感染细胞。相较于质粒转染法，优点在于sgRNA、crRNA和表达cas9蛋白可以持续存在于细胞中，从而达到一个很高的基因编辑效果。

 

图2. 慢病毒转染细胞示意图

 

很多小伙伴对类器官转染方法十分好奇，类器官慢病毒转染和细胞转染大同小异，主要有以下几个问题需要注意：

1.类器官在进行慢病毒转染时需不需要从基质胶里解离出来？

考虑到病毒对于基质胶的穿透性及转染效率，转染时建议将类器官从基质胶中解离出来，用适当培养基重悬在孔板内进行。

2.类器官在进行慢病毒转染时需不需要消化成单个细胞？

类器官在进行慢病毒转染时，消化成单个细胞来转染效率比较高，建议消化成单个细胞进行感染。

3.类器官转染慢病毒多长时间合适？

转染时间可根据实际实验情况调整，通常是转染12-36小时，可以借鉴细胞转染时间。

4.类器官筛选时要不要消化成单个细胞？如果不需要消化，从胶里解离出来就行？还是在基质胶里就行？

类器官筛选不需要消化成单个细胞，在基质胶里就可以筛选，大部分的药物都可以穿透基质胶，作用到类器官上。

 

以下给大家整理了类器官转染步骤：

1.收集类器官并消化成单个细胞后，按2×10⁵/孔铺到24孔板中（细胞密度可以自行摸索）。

2.用含有6μg/ml polybrene（polybrene的浓度可以自行摸索）的1ml新鲜类器官培养基替换原培养基，加入适量病毒悬液，37℃孵育。

3.(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤)4小时后加入1ml新鲜培养基以稀释polybrene。

4.继续培养12-36小时后，如有少量细胞贴壁，可用枪头轻柔吹打下来，混匀，将细胞培养基混悬液收集至离心管中（一般是6-8孔为一组）。300g 4℃ 富集离心5min后移去上清，添加1ml左右类器官传代培养缓冲液（abs9730）转移到1.5ml EP管，重新重悬离心。

5.观察收集到的组织体积，添加25倍组织体积的基质胶（abs9495）重悬混匀（金属冰盒或冰上操作）。

6.以24孔细胞培养板为例，每孔点胶25ul组织基质胶混合物进行铺板（（金属冰盒或冰上操作），将铺好的培养板放入37℃培养箱中10-15min成胶，添加500-750μl 类器官培养基（恢复室温）进行培养。

7.待类器官出现明显增殖现象（一般需要2-3天），更换含有药物的类器官培养基进行筛选（如嘌呤霉素等），没有转染成功的类器官将会裂解凋亡，从而筛出成功转染的类器官。

（图源网络，仅供学习参考用）

 

本期小爱推荐

货号	品名	规格
abs9495	基质胶（低因子、无酚红）	1.5ml*4/ 1.5ml*8
abs9730	类器官传代培养缓冲液	250ml/ 250ml
abs9444	Organotial人肝癌类器官培养基试剂盒	1kit
abs9445	Organotial人结直肠癌类器官培养基试剂盒	1kit
abs9443	Organotial人肺癌类器官培养基试剂盒	1kit
abs9449	Organotial人胃癌类器官培养基试剂盒	1kit
abs9447	Organotial人胰腺癌类器官培养基试剂盒	1kit
abs9589	Organotial人鼻咽癌类器官培养基试剂盒	1kit
abs9739	Organotial人脑胶质瘤类器官培养基试剂盒	1kit
abs9446	Organotial人乳腺癌类器官培养基试剂盒	1kit
abs9514	Organotial小鼠正常肠类器官培养基试剂盒	1kit
abs9516	Organotial小鼠正常肝类器官培养基试剂盒	1kit
abs9515	Organotial小鼠正常肺类器官培养基试剂盒	1kit
abs9643	Organotial小鼠正常胃类器官培养基试剂盒	1kit
abs9583	Organotial猪子宫内膜类器官培养基试剂盒	1kit
abs9591	Organotial奶牛乳腺类器官培养基试剂盒	1kit