分子技术#7：基因编辑入门级学习

一、什么是基因编辑？

基因编辑是指通过基因编辑技术对生物体基因组特定目标进行修饰的过程，可以精确地定位到基因组的某一位点上，在该位点上可以进行特定DNA片段的插入、缺失、修改和替换，从而改变其遗传信息和表现型特征，最终应用于人类疾病治疗、农业生产、基因功能研究等多个领域。

基因编辑技术主要分为基因敲除、基因插入、基因突变和基因重组等四种技术。其中，基因敲除技术是最常用的，它的原理是通过CRISPR/Cas9等基因切割工具，将某个基因的特定序列剪切掉，使其失去功能，从而达到改变物种特征的目的。基因插入技术则是将外源基因插入到特定位置，使其成为物种的一部分，从而改变物种的特征。基因突变技术是指通过基因编辑技术，引入一定的突变，使基因的功能发生改变，从而改变物种的特征。最后，基因重组技术则是通过对基因的重组，改变基因的结构，从而达到改变物种特征的目的。

基因编辑技术发展迅速，其中CRISPR-Cas9技术是最常用的基因编辑工具之一，已经在许多生物体中实现了基因编辑。这项技术的出现为许多遗传性疾病的治疗带来了希望，同时也在农业、生态学等领域展现出了巨大的应用潜力。

 

二、基本步骤

基因编辑的过程通常包括以下步骤：

1. 选取目标基因：根据研究需求选择特定的基因作为目标基因。

2. 设计基因编辑器：根据目标基因的特点，设计相应的基因编辑器，包括指导RNA和Cas9蛋白等。

3. 导入基因编辑器：将基因编辑器导入到生物体内，使其能够准确地找到目标基因。

4. 激活基因编辑器：在合适的时间和条件下，激活基因编辑器，使其能够对目标基因进行修饰。

5. 检测和验证：对经过基因编辑的生物体进行检测和验证，确认基因编辑是否成功，并评估其表型和遗传变化。

 

三、基因编辑器是什么？

基因编辑器是指用于对生物体基因组进行修饰和改造的工具，其中最常见的是CRISPR-Cas9系统。

CRISPR-Cas9系统由两部分组成：Cas9蛋白和指导RNA（sgRNA）。其中，Cas9蛋白是一种能够切割DNA的酶，而指导RNA则能够引导Cas9蛋白找到目标基因组序列并对其进行切割。通过设计特定的指导RNA，可以实现对目标基因组的定点修饰，包括插入、缺失、修改和替换等操作。

除了CRISPR-Cas9系统外，还有其他类型的基因编辑器，如ZFNs（锌指核酸酶）和TALENs（转录激活子样效应物核酸酶）等。这些基因编辑器也都是通过对目标基因组进行修饰，从而实现改变生物体遗传信息和表现型特征的目的。

 

四、 基因编辑中的CRISPR技术是什么？

CRISPR技术是一种基因编辑技术，可以用来对生物体的基因进行精确的编辑。该技术的中文名是“基因剪刀”。

CRISPR-Cas9系统是由两部分组成的：一个是向导RNA，它能够精确地找到目标基因，另一个是Cas9蛋白，它就像一个精准的剪刀，能够将目标基因准确地剪切下来。

首先，向导RNA与Cas9蛋白结合，形成一个复合体。然后，这个复合体被引导到目标基因的位置。Cas9蛋白会与目标基因结合，并剪切下这段基因。

剪切下来的基因可以被科学家重新编辑，比如替换某个碱基对、插入新的基因序列或者删除某个基因片段。一旦编辑完成，新的基因序列会被引导回原来的位置，并插入到原来的基因组中。

CRISPR-Cas9技术的优点在于它的高精度和高效率。与之前的基因编辑技术相比，CRISPR-Cas9技术可以更准确地找到目标基因，并且可以更高效地编辑基因。

此外，CRISPR-Cas9技术也具有广泛的应用前景。它不仅可以用于治疗遗传性疾病，还可以用于治疗癌症、神经性疾病以及其它许多疾病。

 

五、 向导RNA有哪些？

1. sgRNA（单向导RNA）：sgRNA是CRISPR-Cas9基因编辑工具中的一种特殊类型的向导RNA。它通过将crRNA和tracrRNA融合为一条单一的RNA分子，提高效率和便于生产。sgRNA 5′端20 bp序列是与靶序列互补配对的序列，如果编辑某个靶位点，只需要改变这20 bp的序列就可以实现。

2. crRNA（向导RNA的靶向序列）：在CRISPR-Cas9系统中，crRNA主要负责提供与目标基因互补配对的序列。这个序列全长并不与Cas9蛋白结合，只有其中20nt的部分序列在Cas9蛋白剪切DNA时提供目标序列的信息。

3. tracrRNA（向导RNA的非特异性导向序列）：tracrRNA主要与Cas9蛋白结合并形成复合物，帮助Cas9蛋白寻找目标基因。其主要功能是提供一种"通用"的导向序列，与不同的crRNA配对，以实现对多种基因进行编辑。

此外，某些文献中还提到了一种叫做Alt-R^® CRISPR-Cas9系统的向导RNA类型。该系统使用的crRNA和tracrRNA序列模拟的是化脓性链球菌的序列，为了提高效率和便于生产，已经对其长度进行了优化。这种系统使用的sgRNA是通过人的RNA聚合酶Ⅲ启动子U6起始表达的，这个启动子起始转录的第一碱基必须是G。

 

六、 CRISPR-Cas9的实验流程有哪些？

1. 设计sgRNA：首先需要确定要编辑的目标基因序列，并设计针对该序列的特异性sgRNA（单向导RNA），该sgRNA与Cas9蛋白结合，引导其到目标基因的特定位置进行剪切。（像我们这边，您可以提供要编辑的目的基因序列，会有对应的合成好的sgRNA挑选）

2. 构建sgRNA-Cas9载体：将sgRNA和Cas9蛋白一起嵌入到一个可自我复制的病毒载体中，以便将sgRNA-Cas9复合物转入到目标细胞中。

3. 构建sgRNA-Cas9稳转株：通过将sgRNA-Cas9载体转染至目标细胞，并经过多轮筛选和扩增，得到稳定表达sgRNA-Cas9的细胞株，即sgRNA-Cas9稳转株。
（针对这一步。我们有对应的转染试剂供您挑选）

4. 筛选细胞克隆并进行qPCR验证：在sgRNA-Cas9稳转株中筛选出基因敲除成功的细胞克隆，通过qPCR（定量PCR）技术对这些细胞进行基因表达水平检测，以验证基因敲除成功。

5. 阳性克隆测序，选择敲除纯合细胞株：对阳性克隆进行全基因组测序，精确检测基因敲除的位置和大小，并挑选敲除纯合细胞株进行下一步实验。

6. 筛选细胞单克隆测序：在敲除纯合细胞株中筛选单克隆细胞，并进行全基因组测序，以确保基因敲除的准确性和一致性。

除了以上流程，实验流程可能还包含其他内容，比如在转染过程中对细胞进行观察和记录等。具体的实验流程可能会根据实验的目的、条件和要求而有所不同。

 

七、 基因编辑之CRISPR-Cas9技术试剂推荐

1. Dharmacon CRISPR Cas9——无需克隆，任性编辑

① Edit-R Cas9核酸酶，基因编辑成功的关键
高效的基因编辑需要Cas9核酸酶有效的表达，为了满足不同实验目的和实验方法，尽可能适应不同的实验体系，Dharmacon设计不同的Cas9核酸酶表达质粒、Cas9核酸酶mRNA和Cas9核酸酶蛋白，满足不同实验对象和实验环境对启动子活性、筛选标记和实验手段的要求，保障实验的成功率，降低实验工作量。

1）Cas9 nuclease mRNA
☆ DNA-free系统消除了将不需要的外源DNA整合到宿主细胞基因组的可能性
☆ 荧光标签Cas9 mRNA（mKate2或EGFP）可富集基因编辑细胞群
☆ 瞬时表达Cas9核酸酶可减少脱靶，获得更可靠的实验结果
☆ Cas9启动子与细胞系间没有不兼容的问题
☆ 使用DharmaFECT Duo转染试剂轻松共转染Edit-R sgRNA和Cas9 mRNA，或电转染入难转染的细胞 

 

图注：三种细胞系中Cas9核酸酶mRNA的基因编辑

 

2）Cas9 nuclease protein NLS
纯化的Cas9核酸酶NLS蛋白提供了一种随时可用的选择，使研究人员能够以完全无DNA的方式加速基因编辑实验

☆ 直接与sgRNA进行共转染或共电转
☆ 没有添加外源DNA到系统中，有效防止质粒DNA进入宿主细胞基因组的可能性   
☆ 启动子与细胞系间没有不兼容的问题
☆ 瞬时表达Cas9核酸酶以减少脱靶  

 

图注：Cas9 protein RNP nucleofection

 

② Edit-R predesigned All-in-one lentiviral sgRNA
☆ 将sgRNA和Cas9核酸酶表达结合成单个载体，简化递送  
☆ 提供嘌呤霉素耐药性和荧光分选标记，可以选择成功整合载体的细胞
☆ 算法优化保证功能蛋白敲除最大化及脱靶编辑最小化 
☆ 提供甘油菌质粒形式和高滴度纯化病毒颗粒形式产品  
☆ 最常用于难转染细胞类型的敲除，或用于混合慢病毒sgRNA文库筛选后的后续敲除。  
☆ 建议将EGFP选择标记用于编辑细胞的快速富集，一旦荧光表达，就可以进行FACS分析。适用于寿命较短的细胞类型，如原代细胞

 

图注：Edit-R All-in-one慢病毒sgRNA载体示意图

 

2. 其余试剂推荐

货号	品名	规格	产品介绍
jetPRIME	101000046	1.5mL	• 通用型DNA/siRNA 转染试剂 • 卓越的转染效率：可用于不同来源的贴壁细胞 • 更好的细胞活率：极其温和的转染模式 • 性价比高：更少的DNA和转染试剂使用量 • 操作步骤简单：血清，抗生素兼容
TransIT-X2® Dynamic Delivery system	MIR6000	1.5mL	• 高效——卓越的广谱转染 • 多功能——质粒 DNA、siRNA/miRNA 或核糖核蛋白 (RNP) 复合物的递送利刃 • 技术——新型非脂质体聚合物递送
DNeasy Blood & Tissue Kit (50)	69504	50T	从新鲜或冷冻的动物组织和细胞、血液、细菌中提取基因组DNA
QIAamp DNA Mini Kit (50)	51304	50T	从细胞、组织中提取DNA
UCP HiFidelity PCR Kit（100）	202742	100T	高保真PCR Mix
2× Xerox PCR Master Mix	abs60034	1mL	高保真PCR Mix
DNA凝胶/PCR纯化试剂盒	abs60098	50次	胶回收试剂盒
QIAquick Gel Extraction Kit (50)	28704	50T	用于从酶反应中纯化回收DNA或者用于胶回收，适用于DNA片段70bp-10kb
T7 Endonuclease I	P7062-1250U	1250U	用于识别错配DNA、四方向交叉DNA或分支DNA等

 

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