分子技术#2∣终于有人将PCR一次性介绍清楚啦！

分子实验难，小优来相伴！哈喽，我又来啦，小优子今天带大家一起来了解PCR，相信大家都不陌生，毕竟经历了三年疫情生活的我们，已经了解到核酸检测利用的技术就是PCR！话不多说，今天就让我们揭开它的神秘面纱吧，到底是怎么个一回事呢？

分子实验技术流程图

记住这张图，咱们分子的实验兜兜转转就在这里面了，分子技术系列内容也会以上图内容挨个介绍给大家，敬请期待吧！

PCR
发出疑问？它是什么？
上期（分子技术#1∣何为样本保存与核酸纯化？）中有提到：基因是DNA里面真正能够发挥遗传效应的DNA片段。那我们若想要分析/探索基因的遗传信息，则需要大量的DNA片段，例如动物的组织；凶手的毛发、血液、皮肤；古生物；历史残骸；患者的组织；亲子鉴定所需的毛发；植物组织等，可能只能分离出少量的DNA，若想研究其遗传信息，有着很大的阻碍和困难，在1985年，出现了一种方法：可以在短时间内大量复制DNA片段，此方法为PCR，它能将很微量的遗传物质在数小时内扩增数百倍达到检测水平。

PCR：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction），实验过程是利用一段DNA为模板，在DNA聚合酶和核苷酸底物的共同参与下，将该段DNA扩增至足够的数量，以便进行结构和功能的分析。

它是怎么完成扩增的呢？

以上步骤为一个循环，此时已变成了两条DNA链，约需2~4分钟，每次循环之后DNA的量均是前一次的两倍，PCR产物的量一般是以指数速率增长的（2n），但后期由于底物dNTP的消耗以及DNA聚合酶的失活等因素，产量会逐渐减少，受到限制。通常一次PCR反应进行30-35个循环，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

有PCR实验的原理图吗？

备注：此图来自百度百科（图里面标注的①②③，对应的是扩增步骤：变性-退火-延伸）

实验前，我需要提前准备什么？

PS：DNA聚合酶一般分为普通的Taq聚合酶和高保真性聚合酶。若只是判断PCR产物是否存在特异性序列，选普通Taq聚合酶；若想要得到没有任何突变的PCR产物，需选择高保真聚合酶（以上是一般实验思维选择）。另外还需注意，进行T载体连接的时候，要了解高保真的聚合酶所得的产物是没有A末端的，因此你在T载体连接之前需要进行加A反应。或者直接选用普通的Taq聚合酶（此内容可继续锁定接下来的“分子克隆技术”，敬请期待！）

可以仔细讲讲引物怎么选择和设计吗？
1. 为什么要设计引物？
PCR本质是在一对引物的介导下，在体外对特定的DNA片段进行快速扩增的技术。设计引物的目的是为了找到一对可以与DNA模板序列互补的核苷酸片段，实现模板序列的有效扩增。
2. 如何设计引物？
以下设计以NCBI网站设计引物为例
首先，进入NCBI网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/），点击右边BLAST

其次，点击Primer-BLAST，进入设计引物的界面。

然后，此时已进入引物设计页面，开始设置参数。

（1）在对应位置输入基因序列，以及扩增片段大小的最小值和最大值

（2）选择模板类型以及物种

（3）设置完成后，点击Get Primers，等待页面跳转，右侧可以勾选，开启新页面还是在此页面跳转。

（4）系统会根据数据库对你设置的参数进行比对，出现比对结果，自己检查一下是否正确，无误后，点击提交。
（5）根据引物位置、Tm值、以及靶基因是否正确来选择合适的引物。选择引物时，可提前检索一下“引物设计原则”，在原则范围内，选择适合自己的引物。
（6）复制自己选择的引物，发送给公司合成，之后实验验证一下是否好用即可。
注：以上引物设计是以NCBI网站设计引物为例，还有更多引物设计方法，可自行搜索学习！

3. 怎么寻找设计引物的靶标基因序列呢？
若有基因名称，直接在NCBI里的gene里输入点击搜索，结果里边选择你研究的物种，里边会有这个基因的序列等各种信息，下载即可。
若研究的对象有专门的基因组数据库，也可以直接在该数据库搜索。

PCR实验的步骤是什么呢？

PCR实验的整个流程图

有推荐的PCR试剂盒嘛？

货号	品名	规格	产品介绍
PCR
201203	Taq DNA Polymerase（PCR酶）	250U	用于普通PCR
202742	UCP HiFidelity PCR Kit（PCR扩增试剂盒）	100T	用于高保真PCR
203203	HotStarTaq DNA Polymerase（PCR扩增试剂盒）	250U	热启动PCR
206442	UltraRun LongRange PCR Kit（PCR扩增试剂盒）	100T	长程PCR
206143	QIAGEN Multiplex PCR Kit（PCR扩增试剂盒）	100T	多重PCR
abs60075	Two-Step RT-PCR Kit	1kit	①两步法RT-PCR试剂盒具有高效合成能力和高扩增效率 ②可用动物、植物和微生物的总RNA或mRNA为模板
abs60074	One-Step RT-PCR Kit	200T	一步法RT-PCR试剂盒具有方便、快速、灵敏度高、重复性好等特点
abs60056	2×Pfu Master Mix	1mL/1mL*5	①高保真：Pfu DNA聚合酶是使用最广泛的高保真酶，其保真度为普通Taq酶的10倍 ②灵敏：可从0.05ng人基因组DNA模板中扩增出特定基因片段 ③快捷：PCR反应所必需试剂全集于一管之中，数分钟即可完成反应体系配制
abs60055	2×Pfu Master Mix（Quick Load）	1mL/1mL*5	本产品为预混的含有优化浓度的GenStar高纯度 Pfu DNA Polymerase、dNTPs、Mg2+、反应缓冲液以及稳定剂等成分的即用型2倍浓度的PCR溶液，适用于对保真性要求较高的DNA片段的扩增，也可用于DNA片段的末端补平
abs60035	2×Long Taq PCR Master Mix	1mL/1mL*5	①具有快速简便、灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点，可最大限度的减少人为误差 ②适用于长片段PCR反应。使用时只需加入DNA模板和引物既可
abs60034	2× Xerox PCR Master Mix	1mL/1mL*5	本产品是用高保真聚合酶Xerox DNA 聚合酶配制而成的2倍PCR预混液，包含了PCR反应中除引物和模板以外的其它所有组分
abs60033	2×HotStart Taq PCR Mix Loading Dye-free	1mL/1mL*5	本产品为预混的含有优化浓度的HotStart Power Taq DNA Polymerase、dNTPs、Mg2+、反应缓冲液和稳定剂等成分的即用型2倍浓度的PCR溶液，适用于热启动PCR反应
abs60062	2×Fast Pfu Master Mix	1mL/1mL*5	专为扩增克隆DNA片段优化，高保真，错误率仅为1.3x10-6
abs60061	2×Fast Pfu Master Mix（Quick Load）	1mL/1mL*5
abs60036	2×Taq PCR Mix	1mL5/1mL20/1mL*50	——
abs60037	2×Taq PCR MasterMix ( for PAGE )	1mL/1mL*5	——
abs60057	2×HotStart Taq plus Master Mix（Quick Load）	1mL/1mL*5	——
abs60032	2×HotStart Taq PCR Mix with Loading Dye	1mL/1mL*5	本产品为2×预混PCR反应体系，使用时只需加入DNA模板和引物，并用水稀释至1×，具有快速简便、灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点，可最大限度地减少人为误差、节约PCR实验操作时间、降低污染几率，适合大规模基因检测、快速克隆筛选、半定量PCR实验和微量DNA模板的检测等
abs60251	重组高热稳定DNA 聚合酶	1000U	①本品是 94 kDa 的耐热性 DNA聚合酶 ②PCR 产物的 3' 端带 A，可克隆至 T 载体