免疫细胞培养的六个基本流程：样本制备、细胞分选、分型鉴定、扩增&培养、质量优化、后续研究。小优已经给大家详细介绍了《免疫细胞培养通关技巧之样本制备》和《免疫细胞培养通关技巧之细胞分选》，《免疫细胞培养通关技巧之分型鉴定》今天我们继续一起学习扩增&培养的相关知识。
扩增&培养（Amplification and Culture）：从样本制备到细胞分选、分型鉴定，我们终于获得了纯度高、活性好的目的细胞之后，便需要在体外人工模拟其在体内的生长环境，同时保证无菌、适宜的温度和pH，给予免疫细胞充足的营养使其不断生长繁殖，这个过程便是扩增&培养，主要可分为培养体系建立、传代流程、冻存和复苏。
培养体系建立：
不同免疫细胞涉及的细胞因子、激活信号大不相同，因此培养体系也不可同一而论；同一免疫细胞不同来源（如PBMC来源、脐带血来源、iPSCs或ESCs）的具体培养方案也存在差别。小优列举了一些免疫细胞的培养体系以作参考，大家可以针对自己的实验需求进行摸索和优化，以获得扩增效率高、细胞纯度高、活性好的最佳培养方案。
T细胞（human）的活化、增殖培养与分化：
T细胞的激活涉及到两个信号：TCR/CD3与APC表面特异的MHC-多肽复合物结合产生的特异性抗原刺激信号；APC表面多对共刺激分子和T细胞相应受体作用后产生的非特异性的共刺激信号。最常见的用于T细胞体外活化的是Anti-CD3和Anti-CD28，在两者的协同作用下，可使T细胞充分活化[1]。此外，我们还需添加不同的细胞因子以诱导T细胞向不同的方向分化（图1）。
图1 细胞因子在T细胞中的调节和功能[2]
1.将含有1%青霉素-链霉素及5%血清的X-VIVO15培养基恢复至室温，重悬分离后的T细胞，加入anti-human CD3/CD28磁珠（与细胞数量1:1），促进T细胞活化和增殖；
2.加入300 U/mL IL-2使其分化和增殖为效应T细胞；或5 ng/mL IL-15促使T细胞分化和增殖为记忆T细胞[3]。
以上是一篇文献的T细胞分化方案，小优也汇总了体外诱导T细胞分化的一些细胞因子（图2），可供大家参考。
| subtype | cytokine | medium | culture time |
| Th1 | IL-2+IL-12 | RPMI1640+10%FBS+2μg/mL Anti-CD3+0.5μg/mL Anti-CD28+1μg/mL Anti-IL-4+5ng/mL IL-2+10 ng/mL IL-12+55μM β-mercaptoethanol | 96 h |
| Th2 | IL2+IL4 | RPMI1640+10%FBS+2μg/mL Anti-CD3+0.5μg/mL Anti-CD28+1μg/mL Anti-IFN-γ+5ng/mL IL-2+10 ng/mL IL-4+55μM β-mercaptoethanol | 96 h |
| Th17 | IL-6+TGFβ | RPMI1640+10%FBS+2μg/Ml Anti-CD3+0.5μg/mL Anti-CD28+1μg/mL Anti-IFN-γ+1μg/mL Anti-IL-2+1μg/mL Anti-IL-4+20 ng/mL IL-6+1 ng/mL TGFβ1+55μM β-mercaptoethanol | 96 h |
| Treg | TGFβ1 | RPMI1640+10%FBS+2μg/mL Anti-CD3+0.5μg/mL Anti-CD28+1μg/mL Anti-IFN-γ+1μg/mL Anti-IL-4+1 ng/mL TGFβ1+55μM β-mercaptoethanol | 96 h |
图2 体外诱导T细胞分化方案[4]
Tips：原代T细胞一般在体外的培养时间不超过三周，用于功能实验的T细胞建议培养时间在14天以内。
PBMC（human）来源的NK细胞体外扩增[5]：
1.调整分离后的NK细胞密度为1*106 cells/mL，重悬至含有5%血清的X-VIVO 10培养基中；
2.加入200 U/mLIL-2，10 ng/mL IL-15和1*106 cells/mL的K562细胞（丝裂霉素处理灭活）。在15天的扩增过程中，每隔2-3天对NK细胞进行一次传代，补充细胞因子和新鲜制备的K562细胞。
当然，PBMC（human）来源的NK细胞体外扩增的方法有很多：细胞因子−抗体融合、饲养细胞或膜颗粒。小优也找到一篇24.1分的综述，详细列举了不同扩增方案的培养基、添加物、培养天数、扩增效率、细胞纯度，大家可以按需保存！
图2 PBMC（human）来源的NK细胞体外扩增方案[6]
单核细胞（human）的培养以及诱导分化为巨噬细胞[7]：
1.将含有1%青霉素-链霉素及2%人血清的X-VIVO 15培养基恢复至室温，使用上述培养基将分离的单核细胞重悬，细胞密度为1x106cells/mL，放入37°C、5%CO2的培养箱中，等待1小时左右使细胞贴壁；
2.单核细胞经培养后即开始分化为广义M0巨噬细胞。接种后第三天，更换新鲜培养基并加入25 ng/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），以促进M1表型，或50ng/mL巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF），以促进M2表型。第六天，可再次更换新鲜培养基并加入100 ng/mL LPS和20 ng/mL IFN-γ，使细胞极化为M1-巨噬细胞表型，或加入10 ng/mL M-CSF和20 ng/mL IL-4；继续培养24h即可。
树突状细胞的培养[8]：
1.树突状细胞体外培养时一般不增殖，可在培养环境中存活1周或更长时间。如果细胞需要持续培养超过一夜，建议在X-VIVO15添加500 U/mL GM-CSF和500 U/mL IL4，以确保维持DC表型。
2.树突状细胞在10ng/mL TNF-α、5 ng/mL IL-1β、15 ng/mL IL-6和10ug/mL 前列腺素E2（Prostaglandin E2）或0.2 U/mL肝素（Heparin）和50 μg/mL 血蓝蛋白（Keyhole Limpet Hemocyanin）或0.2 U/mL肝素（Heparin）中可分化为成熟的树突状细胞。
传代流程：
贴壁性好的免疫细胞
半贴壁性细胞和悬浮细胞
冻存与复苏[9]：
（1）冻存：在细胞密度达到107 cells/mL时可进行冻存，采用分步冷冻法。具体步骤如下：
1.悬浮细胞500 g室温离心10 min收集细胞沉淀，贴壁细胞胰酶消化并终止后离心收集；
2.弃上清，冻存液重悬细胞沉淀，1 mL分装并做好标记；
3.将冻存管放置-20℃ 1 h；-80℃过夜；转移至液氮中进行长期保存。
（2）复苏：
1.从液氮中取出细胞，37℃水浴快速解冻细胞；
2.将细胞转移到含有12 mL培养基的15 mL离心管中；
3.500 g室温离心5 min，弃上清；
4.加入培养基重悬细胞进行后续的培养。
Tips：复苏的免疫细胞建议通过血细胞计数计算细胞悬液中的细胞数量，并通过台盼蓝染料测定细胞活力。
免疫细胞的扩增&培养至关重要但也困难重重，最后，小优给大家推荐两个好帮手：
Lonza的X-VIVO系列无血清培养基作为明星产品，是针对细胞治疗和基因治疗领域专门开发的人免疫细胞培养基，不含任何外源性生长因子等各种刺激物质，助力细胞治疗研究！
| 大类 | 推荐货号 | 成分异同 | 规格 | 级别 |
| X-VIVO 10 | 04-380Q | 含庆大霉素、酚红 | 1L | RUO |
| BEBP02-055Q | 不含庆大霉素、酚红，含重组转铁蛋白 | 1L | GMP | |
| BP04-743Q | 不含庆大霉素、酚红 | 1L | GMP | |
| X-VIVO 15 | 04-418Q | 含庆大霉素、酚红 | 1L | RUO |
| BEBP02-053Q | 含庆大霉素、酚红、重组转铁蛋白 | 1L | GMP | |
| BP04-744Q | 不含庆大霉素、酚红 | 1L | GMP | |
| BEBP02-054Q | 不含庆大霉素、酚红，含重组转铁蛋白 | 1L | GMP | |
| X-VIVO 20 | 04-448Q | 含庆大霉素、酚红 | 1L | RUO |
备注：RUO，Research use only
R&D systems作为蛋白和ELISA的金标准，可提供基底膜提取物以及生长因子、小分子、培养基和培养基补充试剂。
| 热卖货号 | 产品名称 | 规格 |
| 7954-GM-010/CF | Recombinant Human GM-CSF (CHO-expressed) Protein | 10 μg |
| 216-MCC-010/CF | Recombinant Human M-CSF (CHO-expressed) Protein | 10 μg |
| 285-IF-100/CF | Recombinant Human IFN-gamma Protein | 100 μg |
| BT-004-010 | Recombinant Human IL-4 Protein, CF | 10 μg |
| BT-015-010 | Recombinant Human IL-15 Protein, CF | 10 μg |
| 201-LB-005/CF | Recombinant Human IL-1 beta/IL-1F2 Protein | 5 μg |
| 144912 | Prostaglandin E2 | 10 mg |
| 2812/100 | Heparin sodium salt | 100 mg |
好啦，免疫细胞培养通关技巧之扩增&培养的内容也给大家介绍完了，下一个质量优化，我们不见不散呀！
参考文献：
1. Gunnlaugsdottir, B., Anti-CD28-induced co-stimulation and TCR avidity regulates the differential effect of TGF- 1 on CD4+ and CD8+ naive human T-cells. International Immunology, 2004. 17(1): p. 35-44.
2. Dong, C., Cytokine Regulation and Function in T Cells. Annual Review of Immunology, 2021. 39(1): p. 51-76.
3. Nguyen, D.N., et al., Polymer-stabilized Cas9 nanoparticles and modified repair templates increase genome editing efficiency. Nature Biotechnology, 2019. 38(1): p. 44-49.
4. Sekiya, T. and A. Yoshimura, In Vitro Th Differentiation Protocol, in TGF-β Signaling. 2016. p. 183-191.
5. Li, F., et al., CCL5-armed oncolytic virus augments CCR5-engineered NK cell infiltration and antitumor efficiency. Journal for ImmunoTherapy of Cancer, 2020. 8(1).
6. Fang, F., et al., Advances in NK cell production. Cellular & Molecular Immunology, 2022. 19(4): p. 460-481.
7. K. Plaisance-Bonstaff, C.F., D. Wyczechowska, et al., Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes. J Vis Exp, 2019(154): p. 10.3791/59967.
8. Boudewijns, S., et al., Autologous monocyte-derived DC vaccination combined with cisplatin in stage III and IV melanoma patients: a prospective, randomized phase 2 trial. Cancer Immunology, Immunotherapy, 2020. 69(3): p. 477-488.
9. Raulf, M., T Cell: Primary Culture from Peripheral Blood, in Allergy. 2019. p. 17-31.
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营业执照(三证合一)