肿瘤与巨噬细胞共培养方案

肿瘤微环境

癌症的发生与肿瘤微环境有着密切的联系，肿瘤微环境（Tumormicroenvironment,TME）是指肿瘤细胞产生和生活的内环境，且具有异质性，由肿瘤细胞及其募集的各种基质细胞如巨噬细胞、T细胞、成纤维细胞以及相关细胞因子组成，肿瘤微环境中的巨噬细胞被称为肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associatedmacrophages,TAMs），是TME中最重要的免疫细胞之一。

 

图一 瘤内NK细胞缺乏丰富的膜突起

 

免疫细胞中的“卧底”——TAMs

杀伤肿瘤？

诱导机体免疫应答？

No!No!No!

巨噬细胞可以根据其功能和活化作用分为两种亚型：经典活化的M1巨噬细胞和替代活化的M2巨噬细胞，M1巨噬细胞主要发挥抗肿瘤、促进免疫的作用,与经典活化亚型相反，替代活化的M2巨噬细胞在促进肿瘤生成、恶性肿瘤发生和免疫抑制中发挥作用，TAMs存在于在肿瘤的各阶段，随着肿瘤的进展，M1型逐渐向M2型极化，早期以M1型为主，中晚期以M2型为主，M2型TAMs数量的增多也提示着预后不良。

 

为什么研究TAMs？

图二 2023年TAMs研究热点

首先TAMs对不同类型癌症的生物学行为的影响尚未清晰，探究TAMs的作用机制有助于研究者们开发以TAMs为靶点的肿瘤治疗，肿瘤治疗主要方式包括抑制肿瘤对TAMs的募集和消除肿瘤局部的TAMs，或者通过诱导TAMs表型转化和削弱其促肿瘤功能，因此，近几年有关TAMs的研究日益攀升。

 

TAM与癌症相互作用的研究方式—共培养

共培养是指将两种或两种以上的细胞放在同一培养系统中培养，来研究细胞间的相互作用。其优点是可以模拟体内环境，以便观察细胞与细胞、细胞与培养环境之间的相互作用，通过检测不同细胞因子之间的关系，探讨药物作用机制和可能的作用靶点。常用的方式包括直接接触共培养和间接接触共培养，顾名思义，直接接触式共培养将2种或2种以上细胞按照一定比例培养在同一培养皿中，适用于研究体内邻近组织细胞相互作用以及诱导细胞分化。间接接触式培养包括条件培养基共培养法、爬片式共培养法和嵌入式细胞共培养法，今天主要为大家介绍条件培养基共培养和嵌入式共培养两种方法。

 

条件培养基共培养法

所用试剂：PRMI-1640基础培养基abs9484；胎牛血清abs972；青霉素-链霉素溶液abs9244；配制成含有10%FBS和1%双抗的PRMI-1640完全培养基，PMAabs9107；以THP-1和肺癌细胞共培养为例

（1）选取生长状态良好密度80-90%的THP-1细胞，消化计数后加入PRMI-1640完全培养基，THP-1浓度为5×10⁵个/mL。

（2）加入100ng/mLPMA充分吹打混匀，铺入六孔板置于5%CO2、37℃细胞培养箱培养24h（具体浓度和作用时间可能因细胞状态等因素有所差异），24h后弃掉上清液，PBS洗涤3次，加入1640完全培养基恢复24h。

（3）取一皿生长良好的肺癌细胞，PBS洗涤三次，加入1640基础培养基（不含血清、含1%双抗），培养24h，取上清液4℃3000rpm离心20min，离心后缓慢吸取上清加入10%FBS，吹打混匀，作为共培养条件培养基，4℃可保存1周，或者-80℃冰箱保存半年。

（4）细胞恢复24h，去掉上清，PBS洗涤3次，取一定量的共培养条件培养基加入六孔板中（可设置梯度），补充1640完全培基至每孔2ml，共培养24h。

 

嵌入式共培养（Transwell小室）

Transwell小室是一类小室底具有通透性膜的杯状装置，小室和培养板底部接种不同种类的细胞，培养时将小室放入培养板从而建立细胞的共培养，Transwell小室也可用于趋化实验、细胞迁移、细胞侵袭以及药物转运实验等。孔径分为0.4μm、3μm、5μm、8μm，小于3μm孔径的小室，细胞不能迁移通过，适用于共培养实验。膜材质分为PC和PET，PC膜为半透明，PET膜透明，PET更方便在显微镜下观察细胞的状态。

图三 细胞小室

 

所用试剂：PRMI-1640基础培养基abs9484；胎牛血清abs972；青霉素-链霉素溶液abs9244；配制成含有10%FBS和1%双抗的PRMI-1640完全培养基，PMAabs9107；细胞小室(PET膜，24mm，孔径0.4um，含6孔板)abs7270。

（1）选取生长状态良好密度80-90%的THP-1细胞，消化计数后加入PRMI-1640完全培养基，THP-1浓度为5×10⁵个/mL。

（2）加入100ng/mLPMA充分吹打混匀，铺入六孔板置于5%CO2、37℃细胞培养箱培养24h（具体浓度和作用时间可能因细胞状态等因素有所差异），24h后弃掉上清液，PBS洗涤3次，加入PRMI-1640完全培养基培养至80%左右，收集M0巨噬细胞。

（3）将培养小室置于６孔板上，上层加入癌细胞，下层加Ｍ0型巨噬细胞，两种细胞均匀分布于各层培养48h，细胞比例因癌细胞种类有所不同。

共培养过程中可以观察巨噬细胞的形态变化。

 

本期推荐

货号	产品名称	规格
abs972	胎牛血清（优级）	500mL
abs974	胎牛血清（标准级）	500mL
abs9484	RPMI 1640培养基（含L-谷氨酰胺，不含HEPES）	500mL
abs9107	佛波酯	1mg
abs7270	细胞小室(PET膜，24mm，孔径0.4um，含6孔板)	1箱
abs7274	细胞小室(PET膜，12mm，孔径0.4um，含12孔板)	1箱

本文图片来自网络，仅供学习参考用

 

参考文献

1.苏鹏飞.肿瘤相关巨噬细胞与胃癌细胞的交互作用及其对胃癌耐药和新辅助化疗预后影响的研究[D].北京协和医学院,2023.DOI:10.27648/d.cnki.gzxhu.2023.000214

2.[1]孟凡荣.巨噬细胞极化状态对卵巢癌转移能力的影响[D].天津医科大学,2018.

3.Xiang W, Shi R, Kang X, et al. Monoacylglycerol lipase regulates cannabinoid receptor 2-dependent macrophage activation and cancer progression[J]. Nature communications, 2018, 9(1): 2574.