小优来解答∣siRNA转染，这些FAQ你get了吗？

siRNA溶解稀释要小心
1.溶解条件
专用siRNA Buffer：有长期冻存需求，Buffer可以确保更长时间的siRNA稳定性
RNase-free水：短期内冻存、体内实验（普通Buffer因未针对生理条件进行优化，不能用于体内实验）
2.储存条件
冻干粉可在室温稳定2~4周
溶解好的siRNA可在4℃稳定保存6周，-20/-70/-80 ℃稳定保存至少1年
溶解后分装，避免反复冻融情况发生
3.浓度检测
siRNA的平均分子质量MW=13300g/mol，1uM=13.3ng/ul
Buffer中的盐离子会使RNA读值降低，建议使用RNase-free水溶解后检测

 

转染后，细胞宝宝都飘了怎么办？
1.转染4-6h后换液/补液：此时转染过程已基本完成，不会影响转染效率
2.尽量使用无抗生素的培养基：细胞在有抗生素的条件下会变的非常敏感，如必须使用抗生素，建议6h后更换带抗生素的培养基
3.减少siRNA用量：建议在5-100nM终浓度范围内，找到发挥最优基因沉默效果的最少siRNA用量
4.减少转染试剂用量：按比例调整或更换转染试剂类型
5.选取更早的时间点进行基因沉默分析：如选用转染后24h检测替代转染后48h检测
6.确定靶基因敲低是否会影响细胞活性：如会，需考虑其他实验方案

 

检测结果显示沉默效果很差？
在基因沉默实验中，我们更关注siRNA的沉默效果而非转染效率，因为二者并不完全相关。此外，所有的siRNA都只能保证mRNA水平的敲低，无法保证WB水平的敲低，毕竟siRNA是直接作用于mRNA发挥作用。
针对qPCR检测结果不理想的情况，我们建议：
1.确保所用的试剂都是RNase free，保证siRNA没有降解
2.确保siRNA合成纯度，需PAGE/HPLC纯化且做脱盐处理
3.使用搭配的阴阳性对照，确保实验操作准确无误
4.在不影响细胞活力的情况下，适当增加siRNA、转染试剂用量
5.根据转染试剂需求调整细胞密度，因不同转染试剂偏好的细胞密度比例不同
6.多个时间点检测沉默效果：在24-96h范围内，找到最佳检测时间点

 

正确的对照设置也很重要哦~
1.阴性对照：一种与任何已知的哺乳动物基因没有同源性的siRNA序列，可建立反应基线，用于确定表型或基因表达的变化是非特异性的
2.阳性对照：以内源基因（如GAPDH, PPIB等）为靶标的siRNA，确认RNAi实验操作过程的准确性
3.Mock对照：细胞只用转染试剂处理，用于排除转染试剂可能引起的任何非特异性效应
4.空白对照：使用未处理的细胞作为对照，以测量正常的、基础的基因表达水平
5.荧光转染对照：荧光标记无靶标siRNA，借助荧光成像可有效检测siRNA 转染效率，可用荧光显微镜、共聚焦显微镜、流式细胞仪进行检测

 

优宁维好物推荐：

货号	品名	规格	应用
L-0XXXXX-XX-005	ON-TARGETplus Human XX siRNA SMARTpool	5nmol	siRNA打包方案，提供种属和基因名称即可
D-001830-10-05	ON-TARGETplus GAPD Control Pool-Human	5nmol
D-001810-10-05	ON-TARGETplus Non-targeting Control Pool	5nmol
B-002000-UB-100	5X siRNA Buffer	100mL
B-003000-WB-100	Molecular Grade RNase-free water	100mL
多款siRNA转染试剂可供选择
T-2001-02	DharmaFECT 1 Transfection Reagent	0.75mL	siRNA专用转染试剂，适用于常规易转染细胞系
101000046	jetPRIME	1.5mL	常规易转染细胞系通用转染试剂
101000028	INTERFERin	1mL	siRNA专用转染试剂，适用于几乎所有细胞
301705	HiPerFect Transfection Reagent	1mL	siRNA专用转染试剂，适用于几乎所有细胞