Dimer X二聚体抗原呈递技术

探索抗原特异性T细胞应答的新工具
——Dimer X抗原呈递技术
简单易行的3步曲：加载抗原->染色->分析

前言

主要组织相容性复合物（MHC）基因座编码一组高度多型的细胞表面蛋白，后者在机体对抗原的免疫应答中发挥关键作用。MHC分子通过结合和向T细胞抗原特异性受体（TCR）呈递抗原片段发挥功能。人(人白细胞抗原 / HLA)和小鼠(组织相溶性抗原2/ H-2）MHC分子是在结构和功能上都具有相关性的蛋白质，主要包括两种类型。

MHC I类分子包含两个多肽链。α链是由MHC编码的跨膜多肽，含有三个胞外结构域：α1，α2和α3。第二条链包含一个非MHC编码的多肽－β2微球蛋白（β2M）。由于β2M不具有跨膜结构域，它与α链通过非共价作用连接。外源性Ag经水解形成的肽段与MHCⅠ分子结合，形成Ag/MHCⅠ复合物继而表达在细胞膜上，被CD8＋T细胞（TC细胞）的T细胞受体识别，产生CTL（细胞毒性T细胞）免疫。

MHC II类分子包含两个不同的跨膜蛋白，结合外源性抗原（如细菌和真菌）衍生而来的肽段，并被CD4+T细胞特异识别。内源性Ag经水解形成的肽段与MHCⅡ分子结合，形成Ag/MHCⅡ复合物继而表达在细胞膜上，被CD4＋T细胞（TH细胞）的TCR识别，诱导辅助性T细胞免疫。

CD4和CD8辅助分子与MHC分子的非多形区相互作用而稳定TCR -MHC复合体的形成。

机体受到抗原刺激后产生免疫应答，通过复杂的免疫反应最终清除抗原，保护机体。特异性免疫反应都是由Ag在MHC帮助下被呈递给T细胞，同时协同刺激分子传递T细胞活化的协同刺激信号到核内，从而T细胞活化、扩增并分化为效应细胞，产生效应分子，杀伤受感染细胞、癌细胞，清除病原体。MHC不仅与移植排斥反应有关，也广泛参与免疫应答的诱导与调节。

近来，在疫苗开发和特异抗原免疫应答等研究领域，以可溶性二聚体蛋白经免疫荧光鉴定和流式细胞术分析抗原特异性T细胞显示出越来越重要的作用。BD PharMingen开发的DimerX技术的是基于MHC对抗原肽的自然免疫处理，这种处理是刺激抗原特异性T细胞所必需的。DimerX试剂是由重组的可溶性MHC:Ig蛋白及b2M共同組成。适用于免疫荧光染色以及流式細胞仪分析。

DimerX技术

BD PharMingen通过DNA重组技术将编码MHC I类分子的3个胞外结构域的cDNA插入小鼠IgG1重链基因可变区，再将含有融合基因的表达载体与人b2M基因共转染到一个IgG重链缺陷型鼠浆细胞瘤细胞系J558L，细胞的分泌产物是由重组的MHC:IgG1重链融合蛋白和以二硫键结合到重链的轻链，以及以非共价键与MHC结合的b2微球蛋白形成的复合物。该重组分子有2个抗原片断结合沟，研究者可自行加载任意感兴趣的抗原片断，再以PE标记的anti-Ms IgG1与MHC:IgG1结合，经免疫荧光染色或流式細胞仪分析呈桔黄色荧光。以FITC标记的anti-CD8染色CD8＋T细胞，经FCM分析呈绿色荧光。由此，同时呈现桔黄色和绿色荧光的细胞即为针对目标抗原与MHC I复合物的特异杀伤性T细胞。

BD PharMingen DimerX产品特性：

    ★ 鉴定Ag/peptide特异性T细胞
    ★ 模拟特异性的MHC-Ag-TCR相互作用
    ★ 具有功能性的DimerX易于加载研究者感兴趣的任意抗原肽
    ★ 高亲和力的DimerX加载肽后能与相应的抗原特异性T细胞长时间稳定结合
IgG的铰链区的可运动性使连接在臂上的MHC与TCR更加自由、灵活的结合，大大增强了其结合抗原特异性T细胞的功能

实验流程（3步法）

加载抗原肽段（无菌操作）

1.1 制备目标抗原肽段贮存液：将肽段溶于DMSO制成20mg/ml stock液，可以小量分装冻存于－20℃。至使用时，以无菌的PBS稀释至2mg/ml即可。

1.2 肽段与DimerX混合于PBS(0.2%BSA) pH7.2 (554657),肽段过量比例40, 160, 640.（肽段为 8-10 aa,纯度>95%（HPLC））肽段用量Mp (mg)可用此公式估算：Mp=Md×R×Dp/Dd
Dp＝肽段分子量(dalton)，Dd＝250,000 daltons，
R＝过量肽与Dimer的摩尔比(40,160, 640)，
Md＝Dimer用量
（H-2Kb,d:Ig为0.25~4 mg/106 cells/ test，HLA-A2:Ig为1~2 mg /106cells/test）

1.3 肽段与Dimer X混合液于37℃孵育1 h或过夜，或4℃, 48 h（抗原肽与HLA-A2:Ig需孵育过夜）**以上为针对高亲和力的目的肽段，用被动加载方法即可达到很好的效果。如果目的肽段与MHC亲和力很低，当被动加载效率不高时，可以选用主动加载方法提高加载效率（如酸/碱解吸法加载－略）。
**被动加载的Dimer X/peptide复合物可在4℃保存一周，主动加载的复合物可在4 ℃保存1－2天。

染色

2.1将待检细胞悬于PMG染色液 (554657)，106细胞/50ml

2.2阻断FcR以降低非特异性染色背景
*小鼠细胞用BD FcBlock™(553141/553142)，1 µg/106 cells
*人细胞用纯化的人多克隆IgG，2 µg/106细胞或10%正常人血清，室温10 min

2.3加入DimerX/peptide（0.25，1，4 µg），于4℃孵育1 h，用染色液洗涤

2.4重悬于100ml含二抗 (550083:Anti-Ms IgG1, PE)的染色液4℃，0.5~1 h

分析

3.1洗涤2次，重悬于0.5 ml染色液，上FCM检测，或用荧光显微镜检测。FCM获取细胞数据时，至少采集5～10万淋巴细胞数。

3.2阴性对照的设立：将无关肽段与DimerX孵育或用未加载任何肽段的DimerX。
注意事项：多色分析时加入的针对细胞表面标志抗体(如: CD3, CD8)不能是小鼠IgG1，否则将与二抗(Anti-Ms IgG1,PE)结合导致非特异性染色。对于此种情况，可先将Dimer X/Ag复合物与二抗孵育结合，加purified Mouse IgG1(553485)室温孵育30min (封闭残留的二抗结合位点)，再将此混合液与染色细胞表面Ag的抗体一起与细胞孵育。则可得到低背景、高信－噪比、快速、重复性好的结果。

实验结果实例（图2）

对照组:空载的HLA-A2:Ig DimerX 实验组:加载CMVpp65的HLA-A2:Ig DimerX

图2 为用BD DimerX产品通过流式细胞分析检测巨细胞病毒（CMV）血清抗体阳性病人PBMC中CMV pp65特异的杀伤性T细胞；并以未加载肽段的HLA-A2:Ig DimerX为阴性对照。上图所示百分数为被CMV pp65:HLA-A2/Ig染色的特异性CD8+T细胞数的百分比。

加载：以摩尔数640倍过量的CMV pp65肽段与纯化的HLA-A2:Ig DimerX孵育；
染色：以PE标记的anti-mouse IgG1(551347)为二抗。同时加入anti-CD14-APC和anti-HLA-DR-APC染色非T细胞，以anti-CD8-FITC染色Tc细胞；
分析：流式细胞术获取数据时，排除APC+(即CD14+和HLA-DR+)细胞，选取FITC+(即CD8+)细胞。

新产品聚焦－NK T细胞功能研究之利器

人和小鼠主要组织相容性抗原(MHC)系统分别被命名为HLA系统和H-2系统。HLAⅠ类抗原广泛分布于白细胞等所有的有核细胞表面，小鼠H-2Ⅰ类抗原也广泛分布于各种组织、细胞的膜表面，且小鼠成熟红细胞表面也有H-2抗原。我们知道，MHC基因编码经典MHC分子和非经典MHC分子，如：人HLA-A, HLA-B, HLA-C，小鼠H-2K, H-2L, H-2D这些经典MHC-I类分子将肽类抗原呈递给细胞毒性T细胞。此外，还存在另一类重要的由非MHC基因编码的产物--MHC样分子（MHC like），如：人CD1(a~d)，鼠CD1这些MHC-I类样分子。其中CD1d分子表达在造血细胞和胃小肠上皮细胞，不仅呈递肽类抗原，也呈递酯类、糖酯类抗原，这类抗原由CD1d分子结合并呈递给NKT细胞。

NKT细胞（NK1.1＋T细胞）是T细胞中一个独特的亚群，1987年由Budd等首次报道，其发育、表型及免疫功能与T细胞、B细胞和NK细胞均不同，在自身免疫疾病（如糖尿病）以及肿瘤免疫中起关键作用，因而近年来受到十分重视。

NKT细胞的免疫功能主要是细胞毒和免疫调节作用。一旦被活化，NKT细胞就具有强大能力产生免疫调节因子如IL-4, IL-10, IFN-g等，强有力地影响获得性免疫应答反应，NKT细胞胞浆颗粒中，含有穿孔素，可通过穿孔素发挥细胞毒作用，并表达广泛的细胞死亡效应分子，参与急性移植物排斥反应，抗菌、抗病毒免疫，抗肿瘤免疫等。

如图3 CD1d:Ig是CD1d分子的MHC I类样分子胞外结构域和小鼠IgG1重链可变区的融合蛋白，与b2M图3 (dimerx-图3.jpg)共表达于小鼠浆细胞瘤细胞系J558L。加载目标抗原（糖酯类抗原）后，可用免疫荧光染色或流式细胞术分析特异性NKT细胞。

目前，BD Pharmingen提供纯化的MHC I:Ig和CD1d:Ig可溶性二聚体产品，并且正进一步研发直接荧光标记的DimerX产品。

DimerX产品一览：

产品名称货号规格

– H-2Ld:Ig PURE 550751 0.25mg

– H-2Db:Ig PURE 551323 0.25mg

– HLA-A2:Ig PURE 551263 0.05mg

– human CD1d:Ig PURE 557764 0.1mg

– mouse CD1d:Ig PURE 557599 0.25mg

–Humanb2 Microglobulin 551089 0.1 mg

产品名称		货号	规格
– H-2Ld:Ig	PURE	550751	0.25mg
– H-2Db:Ig	PURE	551323	0.25mg
– HLA-A2:Ig	PURE	551263	0.05mg
– human CD1d:Ig	PURE	557764	0.1mg
– mouse CD1d:Ig	PURE	557599	0.25mg
–Humanb2 Microglobulin		551089	0.1 mg

产品名称	货号	规格
Anti-Mouse IgG1, PE	550083	0.1mg
Stain Buffer (BSA)	554657	500 ml
BD FcBlock™（小鼠）PURE	553141/553142	0.1/0.5mg
Mouse IgG1, k PURE	553485	0.5mg