细胞膜、细胞核特色荧光染料介绍

尽管通过物理光散射信号，您可以得到目标细胞的一些信息，但流式细胞仪真正的分析能力在于其强大的荧光检测功能。荧光染料，如Hoechst, Rhodamine 123, 和 Propidium Iodide可被用追踪细胞周期、检测细胞的膜电位、细胞外排能力及细胞的活性。越来越多的针对不同细胞表面分子单克隆抗体可被标记各种荧光用于识别不同的细胞亚群。

膜染料

膜染料，如PKH家族染料，可被用于长时间荧光标记活性细胞且毒性极小。因此它们被用于细胞追踪、细胞交互和细胞增殖实验。染料通过将其分子插入至细胞膜磷脂双分子层后进行工作。当细胞分裂后，每个细胞上的荧光染料数量也随之减少。目前PKH家族有两个绿荧光染料，PKH2和PKH67。PKH2的半衰期可达8天，而PKH67的半衰期则可达12天。两者在红色荧光通道内的信号极小，固适用于流式细胞仪和荧光显微镜。PKH家族中有个红色荧光染料，PKH26，它在体内的半衰期长达100天以上。如前所述，这个染料也适用流式细胞仪。PKH2和PKH67激发光源为490nm，但PKH26也可为551nm光源所激发。此外这个染料也可被488nm激光有效激发。PKH2和PKH67的发射光约为504nm，正是FITC荧光收集波段，PKH26的发射光为567nm，它适于与其他PKH染料或GFP/CFSE联用。

CFSE

Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester (CFDA-SE或通称为CFSE)是一种膜通透性染料，进入细胞后它通过与赖氨酸侧链及其他氨基酸反应后标记细胞内蛋白。这个染料因其超长的胞内存在时间成为细胞追踪及细胞增殖研究的首选染料。它被频繁地运用于荧光显微镜检测，同时也适用于流式细胞仪。CFSE可被488nm激光激发其发射光为517nm。

用于细胞周期及功能分析的染料

Hoechst 33342

Hoechst 33342染料是一种膜通透性染主要用于活细胞DNA染色来分析细胞的DNA含量。不同于其他DNA染料，它不嵌入DNA，而是特异性地与腺嘌呤/胸腺嘧啶碱基对结合，但并无明显的细胞毒性。

具有高效转运泵功能的细胞可将此染料转运至细胞外，因而引起这些细胞荧光强度减弱。故通过Hoechst低荧光染色就有可能将这些细胞从骨髓细胞群体分离出来。

尽管原始干细胞被证实具有高效的转运能力，但骨髓中其他一定数量的细胞也有类似功能。故Goodell et al于1996年首次介绍的这种方法只能用于初步富集干细胞。Side population实际是指骨髓经Hoechst 33342染色后出现的一种荧光着色现象。Hoechst染料需要紫外光源激发（350nm），受激后发出可见的蓝光（通常使用450nm的滤片检测）。尽管Hoechst所有的发射光都集中在蓝色区域，但将此信号放到足够大后可在红外区域检测到信号（>670nm）。运用双参数点图分别显示这两种信号可得到独立的一群细胞。一群特别稀少的细胞会出现在低强度红色信号区域，这些即是原始的干细胞（如图3）。尽管未充分了解该现象，但其原理可能为Hoechst染料与不同伸展程度染色质结合而出现了红色荧光。

Rhodamine 123

Rhodamine 123是一种阳离子染料曾被广泛应用，根据Rhodamine 123的含量可用于检测线粒体膜电位，但其效率不佳。但多年后发现的某些细胞拥有P糖蛋白-药泵可将染料排出细胞，有可能使线粒体内外的染料水平不一致，故Rhodamine 123检测线粒体膜电位存在缺陷。此外在体内移植实验中发现这个染料的属性还与作用小鼠种类有关。药泵对上述的Hoechst染料染料也起作用。Rhodamine 123可以与Hoechst染料一起使用，用于进一步区分骨髓的各种细胞亚群。Rhodamine 123的激发光为507nm，但也可用488nm激光激发。其发射波长为529nm。

Propidium Iodide

Propidium iodide是一种DNA嵌入式染料。它是溴化乙啶同构异形体，需要细胞破膜后才能进入细胞内。因为死亡细胞可快速吞噬染料，故它也被用于区分死亡与活性细胞。它通过嵌入双链DNA和RNA的链接部并与之形成复合染而发挥作用。这就是众多实验室选择这个染料来标记DNA用于区分细胞周期中的G0/G1, S和G2/M细胞。PI在荧光显微镜上也用作细胞计数的核染料。PI可同时被UV或488nm激光激发。其发射光为615nm。

DAPI

4’-6’-diamino-2-phenylindole (DAPI)最初是用于观察培养细胞是否被支原体污染，但最近被广泛用于DNA含量研究。DAPI与Hoechst类似，可清晰标记DNA用于细胞周期研究，它同样也作用于腺嘌呤/胸腺嘧啶碱基。DAPI的激发光为358(nm)的UV，其最大发射光波长为455(nm)。

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