人PBMC调节T细胞检测操作步骤

时间：2018-04-28 05:34:47

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1、制备PBMC，并用预冷的BD Pharmingen Stain Buffer (BSA) (货号：554657)调整细胞浓度至107/ml。

2、在每个流式上样管中加入100 µl准备好的细胞悬液，细胞数约为1x106个。

表面染色：

3、按照细胞表面抗原染色方法标记CD4和CD25。根据说明书和抗体管上的标识确定抗体用量（一般来说是20ul，可能随批次有差异）。按个人要求设置空白管、对照管、补偿管和样本管。4℃避光孵育20分钟。

4、用预冷BD Pharmingen Stain Buffer溶液洗涤细胞，200-300 g离心5分钟，去上清。

核内染色：

562574：Transcription Factor Buffer Set

溶液配置：

A、制备1x Fix/Perm工作液：用TF Diluent Buffer3：1稀释 4x Fix/Perm Buffer。每个样本通常需要1ml 1x Fix/Perm工作液。每个样本通常需要1ml 1x Fix/Perm工作液。

B、制备1x Perm/Wash工作液：用去离子水4：1稀释5x Perm/Wash Buffer，每个样本需要7.5ml 1x Perm/Wash工作液。每个样本需要7.5ml 1x Perm/Wash工作液。

5、旋涡震荡重悬细胞后加入1ml的1x Fix/Perm Buffer 工作液，并再次旋涡混匀。避光4℃孵育40分钟到50分钟。

6、无需洗涤，直接加入1 ml 1x Perm/Wash Buffer，350g、4℃离心6min并弃去上清液。

7、加入2 ml 1x Perm/Wash Buffer，350g，4℃离心6分钟。弃上清。

8、用80-100 μl 1x Perm/Wash Buffer 重悬细胞，向管中加入适量特异性胞内因子抗体（如FoxP3）或非特异性对照（如Ig同型对照），涡旋振荡10s以充分混匀，4℃避光孵育40-50分钟。

9、清洗前轻轻振荡混匀样本。加入2 ml 1x Perm/Wash Buffer，350g，4℃离心6分钟。弃上清。

10、重复上一步洗涤细胞。

11、350ul stain buffer重悬细胞，并上机检测并分析。注：由于染色过程中使用了细胞固定和破膜，对比起活细胞在形态上会有一定变化，因此FSC/SSC图中圈门时需要做一定调整。

562574：Transcription Factor Buffer Set