流式细胞仪检测细胞凋亡：TUNEL法
时间：2018-04-28 07:20:36 浏览次数：7867
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DNA片段原位标记
凋亡细胞DNA片段原位末端检测技术是指在细胞（或组织）结构保持不变的情况下，用荧光素、地高辛或生物素标记的脱氧尿三磷酸 （deoxyuridinetriphate，dUTP）和末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidy1 transferase，TdT）相反应与凋亡细胞裂解后3'的羟基（-OH）端相结合经显色反应后检测DNA裂解点的技术。
DNA片段原位标记法有两种
（1）原位缺口转移（in situ nick-translation，ISNT）技术，该技术是1994年由Fehsel等提出，它是利用DNA多聚酶I将标记的核苷酸接到断裂的3'-OH端
（2） 原位缺口末端原位标记技术（in situ end labelling technique，ISEL）， 该技术即TUNEL法，于1993年由Wijsman等提出， 它是利用TdT将标记DUTP接到3'-OH端。研究证明，TUNEL的敏感性远高于尤其对早期凋亡的检出TUNEL更为适用。其原因可能是凋亡发生时 DNA大多是双链同时断裂而单链断裂少见。ISNT是依赖DNA多聚酶I的单链修复反应，故阳性率较低。细胞凋亡时DNA断裂早于形态学改变及DNA含量 减少。因此该法较前述各法具有更高的灵敏性，但环死细胞亦有DNA裂点形成。因此环死亦可呈TUNEL阳性反应。
.png) 1 DNA聚合酶或Klenow大片段介导的原位缺口平移（ISNT），实验步骤:
●切片常规脱蜡，梯度乙醇复水化
●将切片组织浸入2×SSC液中，80℃，20min，然后蒸馏水冲尽。
●0.5%胃蛋白酶（pH2.0）37℃消化0～20min，PBS洗尽。
●用滤纸擦干组织块周边液体放入湿盒组织切片上滴加缓冲液A，5min。缓冲液A：50mmol/L Tris-HCl， 5mmol/L MgCl2， 10mmol/L β-巯基乙醇，0.005％BSA，pH7.5。
●弃去缓冲液A，滴加标记液约50μl，25℃温育1h。标记反应液：0.005mmol/L dNTP， 0.005mol/L biotin-16-dUTP， 25U/ml Klenow大片段。
●PBS漂洗2次，各3min。
●内源酶阻断剂阻断15min。
●PBS洗2次，各3min。
●滴加HRP-avidin覆盖组织，室温下30min。
●PBS洗2次，各3min。
●DAB-H2O2显色约5min。
●流水冲洗后，苏木素复染1min。常规脱水，透明，封片。
●阴性对照片在第5步改加不含Klenow的标记液，余同。
2 TdT介导的dUTP缺口末端标记技术（TUNEL）
细胞凋亡中， 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物 酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法 （terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling， TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合 的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培 养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。
.png) 实验步骤：
●切片常规脱蜡，复水，后续过程在湿盒内进行。
●3%的H2O2阻断内源性辣根过氧化物酶30min。
●0.15mol/L的PBS洗2次，每次5min。
●切片浸泡在2×SSC 80℃ 20min。
●0.15mol/L的PBS洗2次，每次5min。
●蛋白酶K或胃蛋白酶消化0～20min。
●0.15mol/L的PBS洗2次，每次5min。
●TdT缓冲液孵育10min。
●TdT反应液37℃孵育1h。
●切片浸泡在2×SSC溶液10min，以终止反应。
●0.15mol/L的PBS洗2次，每次5min。
●链卵白素标记的辣根过氧化物酶孵育30min。
●0.15mol/L的PBS洗2次，每次5min。
●0.04%的DAB显色5～10min，镜下控制时间。
●苏木素复染3～5min，常规复水，透明和封片。
研究证明，TUNEL法的敏感性远高于ISNT，尤其对晚期凋亡的检测，TUNEL更为合适。
使用产品：
3 通过DNA末端转移酶将带标记的 dNTP （多为dUTP）接到DNA片段的3’-OH端，再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果。
一步法：
•实验用2种染料PI染色总DNA：得到细胞周期的信息；
•FITC-dUTP染色凋亡细胞：检测凋亡。
在流式细胞仪488nm激发下，PI发射约623nm荧光，FITC发射520nm荧光。
.png) 二步法：同样，该实验也用PI染色检测细胞周期
FITC染色检测凋亡
（如果不需要周期信息，则可不做PI染色步骤）
.png) 使用产品：
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