BD Phosflow：常见问题解答

使用BD Phosflow抗体时应该选择哪一种破膜剂(perm buffer)?

一般而言，大多数BD Phosflow抗体都是与Protocot III (BD Phosflow Perm Buffer III）相兼容的。由于该溶液对细胞表面分子的影响较大，建议研究者在共染细胞表面分子及BD Phosflow抗体时参考如下链接中推荐的可应用于BD Phosflow protocol-IV的表面标记抗体Validated Cell Surface Makers。

总蛋白与磷酸化蛋白可以同时检测吗？

关于BD Phosflow检测，我们建议比较未刺激样本的基础磷酸化水平(阴性对照）与刺激样本的磷酸化水平，而不是相同样本中总蛋白与磷酸化蛋白的含量。然而某些情况下，研究人员可能会对某种特定蛋白的总量感兴趣 (比如，在此较不同的人肿瘤样本时，阴性对照是无法比较的)。我们提供针对总蛋白的抗体 (如ERK， P38， AKT， Stat等等)，但是目前尚不能应用于BD Phosflow检测一般而言，识别总蛋白抗原表位的抗体未必能识别特异性的磷酸化位点。因此，任何标准的胞内染色流程应该适用于针对总蛋白的抗体。用于免疫荧光的抗体可能适用于流式细胞术。但请牢记，未经流式验证的抗体我们将不能保证结果的准确性，建议研究人员根据实验条件选择合适的试剂。

BD Phosflow实验流程中，优先考虑使用何种抗凝剂 ( EDTA或者肝素）？

一般而言，EDTA与肝素无太大差异，我们未明确比较抗凝剂种类对不同实验操作的影响。然而对于激活条件需要Ca++存在的情况下肝素是最优选择。因为EDTA是一种螯合剂，它会使Ca++大大减少。而用PMA/离子等素刺激全血时，EDTA可以更好的分离单核细胞和粒细胞。

用于BD Phosflow检测的全血样本在溶血后可以在-20℃~-80℃条件下长期保存吗？

由于新鲜细胞再使用BD Phosflow抗体石的信噪比最大，我们从实验室研究人员处得知可先固定细胞、制备单细胞悬液(根据推荐的BD Phosflow操作流程），随后将细胞重悬于PBS中（不含多聚甲醛）并将细胞/PBS混悬物冻存于-80℃。此方法只能使样本保存十几天。请注意，此方法并没有被BD生物科学研发内部广泛验证，所以在BD Phosflow操作流程中推荐使用经红细胞裂解的全血样本。

使用磷酸化的stat抗体时(p-Stat)推荐哪种 Phosflow操作流程？我在进行P-stat蛋白检测时经常染不上或者背景信号很高。

使用BD Phosflow Perm Buffer III (Cat. No. 558050，and Protocol III时p-stat的信号更亮，而在BD Phosflow Perm Buffer II (Cat. Na 558052，and Protocol II)中，即使是高表达p-stat的细胞系荧光信号都较弱。我们发现，由于p-stat的低表达及供者的不同，检测人的PBMCS或者全血中p-stat时更为困难（已发现磷酸化水平具有供者差异性)。所以对于PBMCs我们推荐用protocol III 和perm Buffer III，p-stat信号在未处理时，休眠状态下及血清饥饿的细胞中处于基础水平。这就使它与处理过的样本之间的表达水平差异更为明显。例如，我们在检测GM-CSF刺激之后的stat5的磷酸化表达水平时，会把细胞血清饥饿处理过夜。

BD Cytofix/Cytoperm buffers可用于BD Phosflow检测吗？

不行。BD Cytofix/Cytoperm buffers适用于胞内细胞因子的染色，而BD Phosflow抗体要特异性地选择使用BD Phosflow buffers。BD Cytofix/Cytoperm kit (554714)中的BD Perm/Wash Buffer (Cat.No.554723)不能渗透核膜。所以我们建议使用BD Phosflow perm buffers。在不需要裂解红细胞的情况下，BD Cytofix fixation buffer (Cat.No. 554655)可用于protocols II 或III的固定。如果需要裂解红细胞，我们推荐使用 BD Phosflow Lyse/Fix Buffer (Cat.No. 558049)进行细胞的裂解固定。

在分离贴壁细胞时使用哪种无蛋白酶buffer？

用于分离贴壁细胞的无蛋白酶溶液(用于BD Phosflow检测)是EDTA溶液或者一些商业化的产品(例如无酶分离液)。虽然有人声称这些产品比自配的EDTA溶液效果好，但无胰岛素溶液的效果仍然比不上含胰岛素的溶液。分离贴壁细胞，尤其是分离液中缺少胰岛素时，需要更长的孵育时间。另外，如果先激活细胞，然后分离用于流式细胞术检测，磷酸化信号可能很快就会消失。

应用Perm Buffer III时保持细胞表面染色的最好方法是什么？

很多情况下，用Perm BufferIII (Cat.No.558050)进行常规的固定/破膜操作会完全破坏某些表面抗原(例如CDl6，CD19，CD56和CDl4)的染色。我们已证实有部分细胞表面分子在磷酸化激活、细胞固定、表面染色，随后用Perm Buffer III破膜等一系列操作之后可保持良好的染色效果(Validated Cell Surface Markers)。虽然表面染色的荧光强度会减弱(阴性群与阳性群的分离减弱)但仍能被检测到。已修改的实验操作经内部检测可适用于人CDl6，CDl4，CD19及CD56的标记。

含洗涤剂与含甲醇的破膜剂（Perm buffers）在破膜效果上有什么差异？

含洗涤剂的BD Perm/Wash buffers通常会保持蛋白的二级/三级结构的完整性。而含甲醇的Perm buffers会破坏结构的完整性。对于二聚体的Stat蛋白来说，这种破坏更为有利。但是对于磷酸化位点不结合其他任何物质的蛋白来说并不是必要的。

CD127与BD Phosflow抗体可以共染吗？

不行。CDl27与Perm Buffers I，II，or III不兼容。

FoxP3与BD Phosflow与抗体可以共染吗？

可以。运用perm/Wash Buffer I，以CD4+CD25+的方式圈门，我们就可以从CD4或CD25的细胞群中将FoxP3+群分离。一般而言，进行foxP3染色时，含洗涤剂的buffer(perm/Wash Buffer I）比含甲酵的buffer(perm Buffer II)效果更好。

用小鼠脾细胞进行BD Phsoflow操作时，通常需要用到得细胞密度/细胞量是多少？

根据试验的不同，我们会用4xl0^5/ml的细胞，2ml用于刺激。我们建议设定不同的时间点(例如5min，l0min，15min)以寻找最佳的刺激条件。

在phosflow实验操作中，用anti-human CD3 antibody (UCHT1，Cat.No. 555329)和anti-human CD28 antoody (CD28.2，Cat.No.555725)进行刺激时，为什么推荐阻断步骤？

在刺激阶段，我们建议用正常的小鼠免疫球蛋白Ig阻断剩余未结合的羊抗小鼠Ig，常规情况下，小鼠Ig(lnvitrogen，Cat. No.l0400C)的使用浓度为l0ug/test/l00ul，室温孵育10分钟。(详细步骤请参照BD Phosflow Protocols for TCR Stimulation)

BD Phosflow实验之前需要加磷酸酶抑制剂吗？

由于许多磷酸酶抑制剂会激活细胞(磷酸酶抑制剂有时会用于细胞激活)，我们不建议加入磷酸酶抑制剂来保持蛋白的磷酸化。细胞活化之后迅速用推荐的固定液固定细胞，这是保持蛋白磷酸化的重要步骤。

磷酸化水平的改变是如何计算的？

通常我们会以刺激样本与未刺激样本平均荧光强度的比值来计算不同样本磷酸化水平改变的倍数

BD Phosflow抗体是否与其他胞内标记抗体共同染色？

对的，BD Phosflow抗体能够与转录因子、凋亡标记物（如分割的PARP等）。

BD Phosflow需要用到的细胞数是多少？

这取决于要检测的细胞类型。比如对于细胞系来说，一般收集5000个细胞就足够，但是对于相对稀少的细胞群体，如检测新鲜分离的PBMCs中的Treg细胞时，就需要收集更多的细胞量（50-100k）。切记在样本处理过程中（如洗脱和李欣）会损失部分细胞，而且我们发现细胞损失的程度恰恰与最初始的细胞量成反比，例如最初的细胞越少，损失的细胞就会越多。通常情况下每个样本我们最少准备250,000个细胞。

用流式细胞术进行BD Phosflow染色时，我们收集的细胞数比Westem Blot少，同时就会有更少的目的细胞群，那么磷酸化检测的灵敏度如何保证呢？

在流式细胞术中，一次只检测一个细胞。因此能够检测单个细胞水平的信号通路改变是BD phosflow的最大优势之一，因此也可用于检测混合细胞群体的异质性变化。这个优点就伴随着比其他检测方法如WB灵敏度低的缺点。但是有几点需要明确 : l) 部分Phosflow抗体的检测灵敏度与WB 致 (如p-stat3、5和p-stat6 )。2) Phosflow并不是来取代WB，而且补充WB 的不足。两种检测方法都有各自的优缺点。对于不同的研究课题要选择合适的研究工具。例如，运用WB检测珍贵样本 (尤其是复杂细胞群) 中信号通路是个繁冗、需要投入大量人力和大批样本量的过程。而在研究同质性的细胞群如细胞系的信号通路时. WB就是一个比较好的方法。

不同的破膜剂 BD Phosflow Perm/Wash buffer I、 Perm Buffer II、 Perm Buffer III with Perm Buffer IV之间有什么区别？

Perm Buffer I：含中型洗涤液的Perm Buffer，适用于大多数的细胞表面标记，但对于一些磷酸化标记，如pStats不是最佳的选择；

Perm Buffer II：含中性酒精溶液的perm buffer，其性质介于Perm Buffer I和Perm Buffer III；

Perm Buffer III：含强性酒精溶液的perm buffer，该溶液与Perm Buffer III存在差异。

备注：实验室注意首选Perm Buffer III，在Perm Buffer III不匹配时选择其他的perm buffer。

破膜固定的操作步骤会影响细胞表面标记的染色吗？如果会，应如何减少影响？

通常抗体结合细胞表面标记是通过识别抗原表位实现的。固定/破膜的操作步骤会对抗原表位的结构产生一定的影响。因此，固定/破膜会对细胞表面染色造成不利影响。减少该影响的最好方法就是严格按照推荐的操作流程进行（例如固定液浓度不高于推荐的使用浓度，细胞固定破膜的时间不宜长于推荐时间，且温度不宜高于推荐温度)。另外，细胞经固定破膜后，活细胞表面染色的最佳抗体稀释度将有所改变，因此适当调整抗体稀释度将有助于提高检测灵敏度。

BD Phosttow与Westemblot实验的差异？

两种实验方法的差异详见phosftow实验的优势与局限性说明。这两种实验的优势与劣势是互补的。

BD Phosflow技术的优势 :

l) 多参数数据采集 ;

2) 检测蛋白磷酸化水平的同时，可检测细胞表面及胞内蛋白的表达.

3) 无需细胞富集或分选，即可分析不均一样本中相关蛋白表达水平。

4) 可检测珍贵样本中信号通路蛋白 ;

5) 单细胞水平检测可排除细胞裂解所造成的检测数值均化，这为检测不均一样本中单个细胞蛋白信号提供了可能性；

6) 节约标本。

BD Phosflow技术的局限性：

l) 检测单个细胞内磷酸化蛋白水平的检测限有限；

2) 经验证的流式细胞术磷酸化特异性抗体种类有限；