流式常见问答

1、如何搭配流式抗体荧光标记

流式抗体荧光标记搭配主要由3个因素决定的：流式细胞仪能检测多少个通道、需要同时检测检测多少个指标、厂家的抗体有多少种荧光标记。如果流式细胞仪的通道越多，那么同一份样本能同时做的表面/胞内标志就越多.

A、如何根据流式细胞仪搭配流式抗体

流式细胞仪能检测多少个通道是由有多少根激光决定的以及每根激光的功能决定的，所以首先需要注意两点：流式细胞仪有哪些激光。不同型号的流式细胞仪的同样的一个通道检测荧光素的能力是不一样的.

B、搭配荧光素原则

搭配流式荧光素有2个原则：每个通道只能选择1种荧光素；各个通道之间的荧光素可以随意搭配，但需注意的是，APC和PE-Cy5一起使用的话，上流式以后，容易导致补偿过度。

C、如果检测的指标数目超过了流式细胞仪的通道，怎么办？

如果需要做5个指标，而流式细胞仪只能做4个通道，首先将指标归成2类，再将样本分成2份，分别检测。比如需要同时检测CD3、CD4、CD8、IL-4和 IFN-gamma，那么将样本分成两份，第1份加CD3、CD4、CD8和IL-4，而第2份加CD3、CD4、CD8和IFN-gamma。

2．流式细胞实验的对照应该如何设置？什么是同型对照？

答：①在应用流式技术检测细胞表面抗原时，我们通常要设的一个对照就是同型对照。同型对照：使用与荧光标记抗体相同来源、相同标记、相同剂量和亚型的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色。主要考虑了细胞的自发荧光、FC受体介导的抗体结合和非特异性抗体结合等影响因素。此外，同型对照与MoAb所标记的荧光色素、浓度、F：P比值（标记的荧光色素与免疫球蛋白分子的比值）应该相同为最佳，这对准确设定阴性与阳性细胞的界标有重要意义，切忌使用与MoAb不相匹配的同型对照，最好为同一实验室、采用相同工艺或方法制备（如同一品牌）的产品。

②细胞因子的流式检测时，由于细胞经过了培养刺激活化的处理，为保证测得结果的准确性和客观性，除了同型对照外，还需另设置未刺激对照和刺激对照。未刺激对照：激活时由于BFA等的存在抑制了胞内蛋白的转运，因此在激活过程中产生的抗原与细胞因子会滞留胞内，未刺激对照也应包含BFA等阻断剂。激活对照：激活对照使用细胞表面表达CD69来评价激活与否，如果未达到CD69期望的水平，则激活步骤出了问题，某一试剂可能失活，过期，制备不当或溶剂污染，需制备新鲜刺激剂重新实验。

3．间接免疫荧光标记法如何设置同型对照？

答：同型对照的目的是消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色，而确保检测结果的真实性。在采用间接免疫荧光标记法流式检测时，所设的同型对照是与一抗相同剂量、相同亚型和相同生物素标记（或纯化）免疫球蛋白，之后的荧光标记过程与实验检测组相同即可。

4．哪些客户需要使用同型对照？

A 对流式不是非常熟悉的客户。 B 做胞内流式客户，比如胞内细胞因子、趋化因子和信号蛋白等。 C 使用不常见的标志或者特异性不高的标志的客户，因为客户不熟悉不常见标志的表达情况，根据同型对照可以判断阳性细胞的位置。一些特异性不高的抗体，如多抗，非特异性结合非常多，使用同型对照可排除假阳性。 D 对流式非常熟悉又使用常用的表面标志的客户一般可以不使用同型对照。

5、为什么有时候同型对照的表达会比抗体的表达高？

首先需要检查同型对照的抗体是否加错类型、剂量等。其次，因为有些标志在细胞的表面或者胞内表达不高，而跟其类似的抗原非常多，那么加入同型对照时，同型对照非特异性的结合会超过抗体的特异性，所以会造成这种现象，在细胞表面时如图所示。这个时候推荐使用其他阴性对照，如空白对照等。

详细操作及包含试剂请参见网站说明书。

6．为什么流式细胞术多色分析时要进行荧光补偿调整？

答：在进行流式细胞术多色分析时,待测细胞通常携带两种或两种以上的荧光素,如异硫氰荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)、别藻红蛋白(PECY5)等。这些荧光素被激光激发后发出不同波长的荧光,理论上每一种荧光通过选择恰当的滤光片可被相应的检测器检测到,而不受其他荧光的干扰。但目前这些荧光染料都具有宽发射谱性质,尽管它们的发射峰各不相同,但发射谱范围有一定的重叠,也就是说,相邻的检测器会检测到彼此的荧光信号,例如,FITC检测器会检测到少量的PE光谱,而PE检测器会检测到较多的FITC光谱。这样就影响了检测结果的准确性,因此,多色分析时必须进行光谱重叠的校正。

7．在进行多色流式分析时，如何选择荧光染料标记抗体？

当我们在进行多色流式分析的时候，对分析成功的一个关键影响因素是每个抗体选择何种荧光染料标记。通常会有很多可行的结合，我们在做选择的时候有很多的因素需要我们去考虑。对任何单克隆抗体，其阴性和阳性的信噪比相差四到六倍都取决于荧光素的使用。高密度表达的抗原我们可以应用任何荧光素标记的抗体来检测，低密度表达的抗原就需要我们应用高信噪比的荧光素。

收集细胞，在 BD GolgiStop™蛋白转运抑制剂存在条件下，用 PMA(50 ng/mL)和离子霉素(1 μg/mL)重复刺激。

收集细胞，用 BD Cytofix/Cytoperm™试剂固定破膜后抗体染色（克隆号：MH9A3）

8.流式设门时要考虑到哪些因素？

1)排除细胞碎片 2) 应用合适的荧光阴性对照 3) 排除死细 4) 如果合适，使用一种共享标记物（比如CD45白细胞标记或与之等效的泛-细胞群标记）染色 5) 设置必需的荧光分析点图

9、流式与werstern的区别？

（1）Western 是检测蛋白表达的金标准，可用于检测细胞多种类型的蛋白；流式细胞术的方法多用于检测细胞膜蛋白，虽然也可通过Triton-X100给细胞打孔的方法来检测胞内蛋白，但对于分泌蛋白却是无能为力的；（2）Western测蛋白含量对抗体的量需要很少，一般1：1000左右，而流式对抗体的需要量很大，一般1：50（很浪费抗体）；（3）采用Western方法检测细胞蛋白含量的变化一般要有内参，而流式一般要把每个样品分为两份，同时都做只加二抗（FITC标记的）的对照，这样平均到每个细胞的发光就不用内参了；（4）就个人经验而言，流式用多抗不好，单抗标出来不错。不过流式的应用原理主要还是抗原和抗体反应和western、免疫组化没有本质差别，但是由于免疫组化和western都有酶催化底物的放大体系，因此，流式不适合检测低表达的蛋白，低表达的还是采用western（尤其是化学发光底物更佳）和免疫组化更好。当然，流式最大的一个特点就是，可以定量（百分比），如果是高表达的用流式细胞仪非常有优势。

10、FL1， FL2， FL3 的区别是什么? 是指在不同位置测得的荧光?还是不同波长的荧光?这3个参数到底测的是什么?有什么意义?

其实FL1， FL2， FL3 是指不同的荧光通道.举个例子来说吧.我们用FITC/PE双标记的细胞，在488nm的激光激发下，这两种荧光染料分别发出波长不同的绿色和橙色荧光，然后这发出的荧光再通过滤光片分开，对应的是不同的波长的滤光片，一般在fl1那的是530nm的滤光片，在FL2那的是575nm的滤光片，这样就可以把在一起的荧光分开了。

11、MFI和GFI的意义？

Geo Mean，叫做几何均数（geometric mean），常用于等级资料和对数正态分布资料，和常用的算数均数（mean）的计算方法不同。“ %total或者%gate的结果”代表的是百分率，即细胞占总体细胞或者是门内细胞的百分比；用百分比作为统计指标，适用于荧光表达较强的指标。我看到你的流式图上，检测样本的荧光强度不是很强，属于弱表达的指标，若用百分率统计，就是会失去一部分弱阳性的数据。我建议可以用平均荧光强度（也就是 mean值）作为统计指标，比较荧光强度的变化。

12、6孔板的细胞量能否做流式呀？

对于6孔板而言，每孔的表面积为10 cm2，依细胞种类不同在长满时达到的数量从5*10的5次方到5*10的6次方不等。6孔板绝对没问题的！甚至24孔板也可以正常做。不过用于调试仪器参数的正常细胞要多准备一些。

13、血液里的mononuclear cell（除外红细胞，血小板和破碎的细胞碎片），能不能用细胞大小来gating，只看我关心的细胞？

（1）红细胞还是小一些，无法100%区分，但还是可用把大部分红细胞gate掉。（2）溶血也很重要，如果你的红细胞多的话。（我猜不少，如果用ficol的话）。可以用氯化铵溶液，如ACK（Lonzo），（3）CD45是所有白细胞都表达的，可以用来区分RBC vs. WBC

14、标本必须在抗体染色后30分内检测吗？

SOP是这么说的：（1）Keep samples after staining covered with aluminum foil and at 4 0C （in the refrigerator） until they are run for flow analysis. The samples should be analyzed within 48 hours. Fluorescence loses its brightness if cells are not kept properly： not at 4 0C， or are exposed to light （2）If cells are not fixed with paraformaldehyde， keep the samples on ice and run them immediately after staining is accomplished 因此，如果你没有用PBS洗的话，可以用paraformaldehyde固定，放置48小时。洗了后应该尽快检测。如果做好不能及时检测，建议一般是加入等量的2%的多聚甲醛固定，4度冰箱避光贮存。一般过夜没有问题，第二天同样PBS 2ml 洗涤细胞一次，上机检测。

15．请问能否涡旋已经标记了抗体的样品？

可以。但不要时间过长(快速涡旋)，以免对细胞有损伤。

16、流式细胞检测中怎样把对照和样本的检测结果放在一张图中？

分析获取数据是分开进行的，不可以混在一起上样。首先通过阴性对照调节基本电压，固定条件后进行样品检测，分别保存结果。利用流式软件的multigraph中的overlap可以将阴性对照和样品结果相应图进行叠加，这只是获取数据后对结果的组合和加工。