文献分享# 基因调控文库筛选思路，发现病毒侵染途径中的关键因素

基因调控文库筛选思路，发现病毒侵染途径中的关键因素
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自2003年爆发的SARS，至今的冠状病毒2019-nCoV，这类的严重疾病罪魁祸首冠状病毒，其基因组为线性单股正链的RNA病毒，具有高突变率和快速适应的潜力，那么病毒的耐药性对于抗病毒药物的研发则是一个严峻的考验。而对于靶向细胞的功能，相较于靶向病毒功能的研究，能够更大程度减少耐药性的发展。结合病毒在其复制周期中，与宿主细胞在多层面上的相互作用，则是其抗病毒感染的关键因素，从而可作为药物开发的抗病毒策略。

今天小优就为大家带来一篇关于SARS冠状病毒的研究，一起来看看莱顿大学的研究人员，如何利用基因调控文库筛选病毒侵染宿主途径中关键因素，为您提供高效的科研思路。

以人激酶组为靶点，利用siRNA文库筛选影响SARS冠状病毒复制的主要因素
为了进一步了解宿主因素在SARS-CoV复制周期中的作用，2013年莱顿大学研究人员以多种细胞功能调节的关键因子——人蛋白激酶组779个基因为靶点，利用RNAi基因沉默技术进行系统的功能基因组学筛选。

293/ACE2细胞作为宿主细胞接种于779个孔中，以人激酶组779个基因为靶点，使用Dharmacon ON-TARGETplus SMARTpool siRNA-蛋白激酶文库，同时转染779个基因siRNA至293/ACE2细胞，并于基因下调表达48h，感染MOI=10重组GFP标签SARS冠状病毒（SARS-CoV-GFP） 24h。同时设置平行对照组，仅完成779个基因siRNA转染同时下调表达，验证其siRNA转染对细胞活性的影响。最终通过在96孔板中测定SARS-CoV-GFP的荧光GFP表达值。

通过对GFP荧光表达值分析，发现在同时下调779个基因mRNA的前提下感染重组SARS-CoV-GFP，并同时设置无任何靶基因敲低并感染重组SARS-CoV-GFP的对照组，发现有38个基因的下调表达后，与对照组相比其GFP表达增加至少1.5倍，有10个基因的下调表达后相较于对照组GFP表达下降至少2倍以上。

初步将这些通过siRNA文库筛选得到的关键基因结合IPA软件分析，其不仅发挥抗病毒或病毒前体复制的关键作用，同时也参与多种细胞途径，如细胞凋亡、细胞免疫应答、生长因子信号传导、细胞稳态、复杂脂质的代谢以及细胞内和第二信使信号传导。

通过前期siRNA文库筛选得出，COPB2的下调表达后感染SARS-CoV-GFP 重组病毒，其荧光报告基因GFP表达下调82%，由此推断COPB2作为病毒前体复制的最为关键因素。

为进一步验证该结论，通过转导COPB2 shRNA慢病毒至293 / ACE2细胞，敲低COPB2的表达至使下调约70% (Fig 1A)，并且COPB2表达水平敲低并不影响细胞活力 (Fig 1B)。随后用SARS-CoV-GFP（MOI 0.01）感染COPB2敲低表达的细胞，导致在32 h时SARS N蛋白和GFP表达下降。为了验证重组SARS-CoV-GFP感染敲低实验能够正确反映野生SARS-CoV的特征，同时分析了感染也省SARS-CoV后24小时内COPB2耗尽细胞中SARA N蛋白的表达明显减少 (Fig 1C)。并且来自SARS-CoV-GFP感染细胞（32 h p.i.）和野生SARS-CoV感染细胞（24 h p.i.）的培养上清液的滴定显示，两种病毒均降低了2-3个对数（Fig 1D）。

COPB2作为涂层蛋白复合物的其中一个亚基，可驱动形成COPI涂层的囊泡，在早期分泌途径中发挥逆行转运作用，同时在这一过程中，GBF1激活ADP-核糖激化因子1介导COPI包被的囊泡形成，而COPB1和GBF1作为早期分泌途径的蛋白质，对于SARS-CoV复制同样很重要。为进一步证实COPI包被的囊泡对SARS-CoV复制的重要性，针对COPB1和GBF1分别转染其特异性siRNA至293 / ACE2细胞，于48h后分别敲低表达水平，感染SARS-CoV-GFP（MOI 10）,并于24h后重组病毒GFP表达量降低约83%（COPB1）和89%（GBF1） (Fig 1E)。

综上所述，这些数据表明，COPB2和COPI涂层的囊泡在SARS-CoV复制中起着至关重要的作用。

经由siRNA蛋白激酶文库筛选，除了筛选得出SARS-CoV前提复制的关键因素，还有可使重组病毒GFP表达增强至少2倍的抗病毒关键因子——PKR。为进一步验证PKR在SARS-CoV复制中的抗病毒作用，同样的思路，对其PKR进行敲低表达48h，并感染野生SARS-CoV 24h,分析得出经PKR蛋白水平敲低后，SARS N蛋白表达量上调，并且病毒感染上清液滴度增加了约1个对数。说明了PKR在SARS-CoV感染的细胞中具有真正的抗病毒作用（Fig 2）。

该篇文献利用系统功能基因组学的方式筛选得出影响SARS-CoV感染宿主的关键因子PKR和COPB2，并通过基因调控结合SARS-CoV感染所发生的表型或表达情况等，进一步证实了宿主PKR和COPB2在其病毒侵染宿主过程中发挥的抗病毒及影响病毒前体复制关键作用。并且文章中也提及到，利用该种方式不仅针对SARS-CoV，还确定了多种RNA病毒复制的关键因素。为后续进一步深入的探讨提供了一个数据起点及理论基础，帮助病毒侵染宿主过程中新靶点的发现，以及后续的抗病毒治疗等。

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Cell Cycle Regulation

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Drug Targets

Druggable Genome

Epigenetics

GPCR

Ion Channels

Membrane Trafficking

Nuclear Receptors

Phosphatases

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Protein Kinases

Serine Proteases

Transcription Factors

Tyrosine Kinases

Ubiquitin Conjugation Subset 1

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