低频细胞分选注意事项

时间：2020-06-04 00:23:19

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1、标本要新鲜，死细胞和碎片不应超过10％，如果死细胞过多，建议密度梯度离心提取单个核细胞。

2、要有足够的细胞量，起始细胞应该尽量多。

3、分选前过400目滤网（38um）。

4、严格按照说明书操作，注意分选器放置方向（MACS标记正向），分选柱紧密卡入分选器中。缓冲液按照说明书配制，操作中尽量减少细胞丢失，注意选用合适的离心机和离心管，离心力按照说明书操作，300-400g，10分钟，离心管最好选用塑料尖底离心管，如BD或者Falcon公司的15ml离心管使用塑料尖底离心管。去上清时仔细操作，吸取上清时可以残留少量（残留平行细胞界面1mm水膜）。

5、缓冲液润柱后加标本和缓冲液洗柱时，每次等到前一次液体快流空时再加新的液体，加样要轻，不要有气泡。

6、如果过一个分选柱纯度不理想，可以再过一个新的分选柱增加纯度。

7、分选后流式细胞仪检测标本最佳细胞量2X10e5以上，如果得不到，最初2例所有分选得到的细胞都用来做流式细胞仪检测，结果满意，后面的不必再做检测，一律用来做后续实验。

8、流式细胞仪检测4管：分选前标本：对照管、检测管。

分选后阴性管标本：检测

分选后阳性管标本：检测

9、流式细胞仪检测时每管之间严格冲洗，直至获取蒸馏水无细胞。

PS：

1. 细胞培养：癌症细胞多数为贴壁培养，培养时，不要铺满整个培养器皿才收集！德国技术建议不要超过80%。

2 收集细胞：同时加入胰酶和dna酶，可降低粘性。

3. 一定要用滤器过滤！一定要确认死细胞的数量，超过20%，就不要做了！原则上不能高于10%

4. 上柱前重悬：说明书上10e8的细胞用500ul重悬，此时降低细胞数量，加大重悬体积到1ml