使用FicollPaque™分离人PBMC

时间：2020-06-04 00:32:00

浏览次数：1660

1、事前准备

PBS-EDTA：磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.2，含2 mM EDTA。

▲ 注意： EDTA可以用其他补充剂代替，例如抗凝柠檬酸右旋糖配方A（ACD-A）或柠檬酸磷酸右旋糖（CPD）。

2、使用FicollPaque™分离人PBMC

▲注意：外周血或血沉棕黄层不应超过8小时，并应补充抗凝剂（例如肝素，EDTA，柠檬酸盐，ACD-A或柠檬酸盐磷酸右旋糖（CPD））。

（1）用PBS-EDTA缓冲液体积的2-4倍稀释细胞。

▲ 注意：血液样本越稀释，单核细胞的纯度越好。

（2）在50 mL锥形管中的15 mL Ficoll-Paque™上小心地铺上35 mL稀释的细胞悬液。

（3）在不带制动器的摆桶式转子中，在20°C下以400×g离心30–40分钟。

（4）吸出上层，使单核细胞层（淋巴细胞，单核细胞和血小板细胞）在相间不受干扰。

（5）小心地将单核细胞层转移到新的50 mL锥形管中。

（6）用PBS-EDTA填充锥形管，混合并在20°C下以300×g离心10分钟。小心地彻底去除上清液。

（7）为了除去血小板，将细胞沉淀重悬于50 mL PBS-EDTA中，并在20°C下以200×g离心10–15分钟。小心地彻底去除上清液。

▲ 注意：此步骤将在随后的MACS®细胞分离中提高目标细胞的纯度。

（8）重复步骤7。大多数血小板在200×g离心后仍保留在上清液中。

在适当量的PBS-EDTA中重悬细胞沉淀，然后进行“人Pan T细胞的分离”。

▲ 注意： PBMC可能会在冰箱中用含有0.5％BSA或自体血清的PBS储存过夜。

（9）箱中存放超过一天的细胞。进行磁性标记之前，请至少清洗一次，然后将细胞重悬在适当的缓冲液中。