手动制备小鼠肿瘤细胞悬液

1. 前期准备工作

1.1 分组标记：根据实验分组需求取若干六孔板，标记荷瘤小鼠信息。六孔板中每孔加入 3 ml DMEM 高糖培养基，将六孔板置于冰上待用。

1.2 配制肿瘤组织消化液：将预先配制的 100× 消化液母液 (含 100 mg/ml 胶原酶I 和20 mg/ml DNA 酶I) 用含 5% FBS 的DMEM 高糖培养基稀释 100 倍，即最终工作浓度为 1 mg/ml 胶原酶I 和 200 μg/ml DNA 酶I。将 1× 消化液置于 37 °C 水浴锅预热待用。

1.3 器械准备：根据实验分组需求准备适量的剪刀镊子，用双蒸水洗净后 75%乙醇消毒，烘干备用。

2. 肿瘤组织的分离

采用颈椎脱臼法将荷瘤小鼠处死，喷洒 75%乙醇消毒。左手持弯镊，右手持剪刀在肿瘤右侧 1 cm 处沿肿瘤边缘剪开一长约 2 cm 口子。左手捏住剪开处的皮肤向外翻折，可清晰见到肿瘤附着于皮下。用剪刀沿肿瘤边缘轻轻剪开，将肿瘤剥离，注意肿瘤若有溃烂，则避开溃烂之处。将剥离下来的肿瘤组织放入预先准备好的六孔板内。

3. 肿瘤组织的剪碎

待全部肿瘤剥离完毕，用移液枪吸出预留 DMEM 高糖培养基，余大约 0.1 ml，以免在剪碎过程中肿瘤组织干燥。手持剪刀小幅度高频率剪碎肿瘤组织，将肿瘤组织剪成泥浆状，肉眼无法看见清晰组织块。注意以上步骤均在冰上操作。

4. 肿瘤组织的消化

将肿瘤组织剪成泥浆状后，每孔加入 2 ml 1× 消化液，用 1 ml 枪头将肿瘤组织碎末打散，置于 37 °C 恒温细胞培养箱消化 30 min，每隔 10 min 将六孔板取出晃动混匀一次。注意严格按照时间消化，以免影响免疫细胞活性；可根据肿瘤大小调整1× 消化液的用量。

5. 制备肿瘤细胞悬液

消化完毕后，将六孔板取出放于冰板上，每孔加入 4 ml DMEM 高糖培养基 (含 5% FBS) 终止消化。用巴氏吸管吸取肿瘤组织悬液至 70 μm 细胞滤网过滤，同时用 1 ml 注射器后部研磨遗留在滤网上的组织块 (注意研磨时切勿用力，易将脂肪等带入细胞悬液中)，用 DMEM 高糖基础培养基冲洗滤网上的组织块，所得肿瘤悬液 4 °C， 850 × g，离心 5 min。

6. 染色前封闭

由于髓系细胞表面表达较多Fc 受体，容易对流式抗体有非特异性结合，故采用预先阻断Fc 受体封闭。离心后弃上清，根据沉淀多少加入适量 FACS 缓冲液混匀，取 10 μl 细胞悬液计数，将悬液细胞密度调至 2 × 107 个/ml。取 100 μl 细胞悬液于 U 底 96 孔内，按 100:3 比例加入抗 Fc 受体抗体 (即每 100 μl 细胞悬液加入 3 μl 抗Fc 受体抗体)，4 °C 孵育 30 min。

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