取已经免疫的小鼠,剪尾取血,并分离血清供作为阳性对照。
1. 小鼠颈椎脱臼处死,75%乙醇浸泡5分钟,取出小鼠置于无菌操作台上,左腹侧朝上;
2. 在小鼠左腹侧中部剪开小口,撕开皮肤,暴露腹壁,可见红色长条状脾脏;
3. 在脾脏下侧提起腹膜,剪开后上翻,暴露脾脏,用镊子提起脾脏,眼科剪分离脾脏下面的结缔组织,取出脾脏;放入盛有5ml 不完全培养液的培养皿中冲洗,剥去其周围的结缔组织。
4.
A、梳刮法:脾脏可用镊子轻轻梳刮,避免将脾脏弄成碎片,将细胞悬液吸入离心管中,自然沉降5分钟,将悬液移至另一离心管中,弃去较大的组织块,离心沉淀细胞;
B、钢网研磨法:将脾脏放置不锈钢网(100或200目)上,用注射器针芯轻轻研压脾脏,获细胞悬液;
C、酶消化法:将脾脏用镊子夹碎,加入400 u/ml胶原酶(III型)5ml/只脾脏,37度消化20分钟,用尼龙网过滤,得到单细胞悬液。
注:
1. 一般6-8周龄小鼠,根据品系不同,可得5-20×107细胞/只小鼠;
2. 手术器械灭菌:术前高压灭菌外,也可将手术器械泡在95%酒精的小容器中,使用前取出器械,在酒精灯上烧灼去除酒精,即可保证无
菌,此法较为简便。
菌,此法较为简便。
从单细胞悬液中分离淋巴细胞:
1. 另取无菌试管,先加入淋巴细胞分离液,然后将试管倾斜,略放平,吸取刚刚制备的细胞悬液缓慢的加入试管中,一般分离液和细胞悬液的体积比为1:2,要轻要慢,不要冲破了淋巴细胞分离液和细胞悬液的界面。选用适合自己分离目的细胞的离心力和时间进行离心。个人用1500转/分钟,20分钟。
2. 离心后取出试管,可以看到不同的分层,一般上面是非细胞成分和细胞碎片,接下来是单个核细胞,再往下是红细胞等。吸走上层非细胞层弃之,吸出单个核层在另外无菌试管中,因为淋巴细胞分离液对细胞有毒性作用,加入PBS 离心洗两遍(PBS1000转/分钟,10分钟)。
3. 洗好的细胞加入1640培养液和20%的血清中重悬,缓慢加入已经制备好的尼龙毛柱子中,封好,放37度孵育一小时。一小时后取出,超净台内将柱子立起,针头下面放无菌试管(我们的柱子是用大号注射器做的),以HANKS液和血清先后缓慢冲洗,巨噬细胞贴在尼龙毛上不下来,B细胞也相对吸附冲洗下来的不多,所以冲洗来的大多是T细胞,纯度可打到80%到90%,再次冲洗并且用力挤压,这样得到的就是B细胞。得到的细胞可以以1640加血清配制的培养液进一步培养或做它用。但是淋巴细胞分离液得到的细胞只能算是粗分,如果实验要求高最好选用磁珠或流式分离。
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