【文献解读】多糖纯化：鱼腥草多糖HCP-2的结构表征和免疫调节作用

多糖是高等植物、动物、微生物细胞中一类非常重要的天然大分子物质,由于多糖的结构多样性，其生物活性功能研究也越来越受到广泛的关注。其中天然多糖的免疫调节已成为近年来研究的热点之一。在这里，小优也将关于天然多糖免疫活性研究的相关文章做了简单的统计。

为了深入研究多糖的生物活性功能, 科学认识多糖结构，对多糖的基础研究和应用具有重要意义，因此在研究多糖的生物活性过程中，多糖的分离纯化是必不可少的研究方法。而要分离出较纯的多糖，设计一个合理的纯化策略是实验成功的前提。今天小优整理了一篇文章的研究思路来和大家一起分享，研究多糖纯化的老师，可以借鉴一下！

研究概述

本文通过利用离子交换和凝胶过滤层析技术对鱼腥草（折耳根）中的多糖物质进行分离纯化，命名为HCP-2，然后通过多种方法对该多糖进行结构表征，发现HCP-2是一种果胶多糖。最后对HCP-2进行了生物活性测定，结果表明HCP-2是一种免疫增强剂。

实验步骤

多糖的分离提取

多糖分离操作步骤如下：

多糖分离纯化示意图

1、取鱼腥草杆叶部分进行研磨，用沸水提取三次后，离心收集上清。

2、在低温下用80%乙醇进行醇沉。

3、得到沉淀后用Sevage试剂水解蛋白，离心得到上清，冻干后得到粗糖。

4、用蒸馏水溶解粗糖后，用DEAE Sepharose CL-6B column (5.0 × 70.0 cm)进行第一步纯化，分别用蒸馏水，0.1、0.2、0.4 M NaCl和含有0.2 M NaOH 的1.0 M NaCl依次洗脱，最后收集0.2 M的洗脱组分。

5、将0.2 M的洗脱组分通过Sephacryl S-500 HR用水洗脱，分离得到多糖，即HCP-2，得率为4.6%。

HCP-2的表征

通过HPLC、PMP衍生UPLC分析、傅里叶红外光谱和核磁共振对HCP-2进行表征，发现HCP-2是由半乳糖醛酸构成的分布量比较均一的果胶多糖，分子量为60kDa。

HCP-2的HPLC图

HCP-2的PMP衍生物的UPLC色谱图

HCP-2生物活性测定

1、PBMC的细胞因子测定

将人PBMC培养物与HCP-2一起温育12小时，然后用ELISA试剂盒检测上清的细胞因子，结果发现IL-1β，TNF-α，MIP-1α，MIP-1β和RANTES对HCP-2浓度依赖性升高。

2、Toll样受体4（TLR-4）参与HCP-2促进PBMC中IL-1β的释放

将PBMC与浓度递增的TLR-4抑制剂（LPS-RS）预孵育15分钟，然后用HCP-2处理12 h。使用ELISA试剂盒测定上清液中的IL-1β水平。结果表明，LPS-RS以剂量依赖性方式抑制了由HCP-2诱导的IL-1β的产生。

LPS-RS对HCP-2诱导的TLR4的拮抗作用

本文研究表明HCP-2显着提高了IL-1β，TNF-α，MIP-1α，MIP-1β和RANTES的浓度，这表明HCP-2可用作免疫增强剂，并提供证据表明这种多糖可能在一定程度上解释了鱼腥草水提取物的免疫增强作用。

温馨小提示：

看了文章中的多糖纯化策略，那有的老师就困惑了，那我的多糖应该怎么纯化呢，是不是可以按文献上的来做，别担心，小优也在这里给大家介绍了一般情况下多糖的纯化策略。

多糖纯化经典流程

一般对于天然的多糖纯化第一步建议大家用阴离子交换柱层析，其中Capto系列的填料载量高、流速快，可以帮助大家分离得到很好的效果哦。然后第二步用凝胶过滤进行层析，在这里大家要注意啦，多糖由多个单糖通过糖苷键链接组成，侧链也会有很多支链，所以它的实际分子量比理论分子量还要大，因此我们在选择凝胶柱的时候分离范围要比实际分子量大一个数量级哦！！！

现在大家应该不会发愁纯化多糖了吧！