Percoll 、Ficoll 深度详解，让你的细胞分离不再难

NO.1 细胞分离液有哪些？区别的是什么？

1) 细胞分离产品主要分 Percoll 和 Ficoll 两种。

Percoll 的应用范围较广，不仅仅适于分离不同密度的细胞，还可分离亚细胞器和病毒，可实现从1.02-1.3 g/ml范围内的密度梯度离心分离。

Ficoll是用来分离特定密度细胞的分离液（1.077, 1.084 和 1.073 g/mL三款），适于已知密度细胞的分离。

NO.2使用细胞分离液在离心过程中对离心升降速的快慢有什么要求？

整个梯度离心要求慢升慢降，需要在离心机里设置加速度，一般有 1 到 9 级可选。Percoll 升降都要 3 的加速度;  Ficoll 升速时没有要求，降速时要慢，建议关闭刹车，设置加速度为 3。

NO.1 Percoll的保存方法？

Percoll 在没有被打开时，在室温下可以保存5年，打开后短期内可以保存在4-8℃，使用时拿到常温先放置一段时间。如若长时间不使用，Percoll可以冷冻保存在-18℃，拿出融化时会形成梯度，在使用前必须先颠倒混匀后使用。

NO.2 Percoll的是无菌的吗？

Percoll/Percoll PLUS在生产过程中是经过高温灭菌处理的，打开后可以直接使用。如果需要灭菌，可以使用条件为 120℃，30 min，但是注意只有原液可以灭菌，配置后的溶液或者SIP不建议灭菌。

NO.3  Percoll 和 Percoll PLUS 的区别是什么

Percoll是PVP涂层硅胶介质，Percoll PLUS是共价偶联烷硅涂层硅胶介质，性质更加稳定；Percoll PLUS内毒素含量较低（<2EU/ml），有法规文件（RSF文件）支持，可以用于临床研究，Percoll 仅能用于科研。

NO.4 Percoll分离细胞需要的密度？

建议参考文献配置相应的密度。

以下密度可以作为参考：

NO.5 Percoll配置方法？

Percoll 的配制一般有两种方法：

1、按照百分比两步稀释法：首先用一份的1.5M NaCl或者2.5M蔗糖加九份Percoll原液，得到100%的SIP溶液。在此基础上，再按照百分比使用0.15M的NaCl或者0.25M的蔗糖进行配置。

2、按照密度一步稀释法：按照以下公式进行计算。

NO.6 Percoll的PH值是多少？

Percoll 的pH 大约为9.0，在不改变任何性质下可调节为5.5 到10.0。如果pH 降低到5.5 以下，可能发生胶凝作用。在存在二价阳离子时也会导致凝胶作用，升高温度会加剧这种作用。

NO.1 Ficoll-Paque PLUS和PREMIUM的区别是什么？

PREMIUM 是 Ficoll-Paque PLUS 的基础上在符合 GMP 的车间生产的，有法规文件的支持（RSF 文件），可以用于细胞治疗和临床研究，PLUS 只能用科研。Ficoll-Paque PREMIUM 有三个密度（1.073,1.077,1.084），Ficoll PLUS 只有 1.077 这一个密度。

NO.2 Ficoll 的保存条件是什么？

Ficoll应避光储存于4-30℃之间，在该条件下可以保存3年。打开后建议避光存储于 4-8℃，使用前先放置在常温一段时间。不建议冷冻储存。

NO.3 Ficoll 是无菌的吗？

Ficoll在生产过程中已经进行灭菌处理，可以直接使用。

NO.4 用 Ficoll 分离人外周血中淋巴细胞时，淋巴细胞所处的位置如何，各层分别是哪种细胞？

离心完成后，从管底往上依次为红细胞-粒细胞-Ficoll 细胞分离液-淋巴细胞-血小板-血浆。在取淋巴细胞时要小心将上层的血浆和血小板移除后再吸取淋巴细胞。

NO.5 用 Ficoll 分离人外周血中淋巴细胞时，血液样品和Ficoll的比例是如何的？大体积样品该如何处理？

①　按照样品：Ficoll 的高度比约为 3:2.4 或体积比 4:3 的比例进行样品和分离液的添加。

②　大体积样品可以通过增加离心管的直径来进行分离，保持同样的高度比例。增加离心管直径并不影响所需的分离时间。

NO.6 Ficoll 分离人外周血单个核细胞 (PBMC) 的原理是什么？

根据细胞密度的不同进行分离。单个核细胞的体积、形状和比重与其他细胞不同，红细胞和多核白细胞比重较大，为 1.092 左右，淋巴细胞和单个核细胞比重为 1.075 左右。利用 Ficoll 作密度梯度离心时，各种血液成分将按密度梯度重新分布聚集：血浆和血小板密度较低,，悬浮于分离液的上部；红细胞与粒细胞密度较大，沉于分离液的底部；PBMC 密度稍低于分离液，位于分离液界面之上，移去上层组分就可获得 PBMC。

NO.1 Ficoll Paque PLUS 分离人外周血中的 PBMC，血小板污染比较多，如何改善？

可以从如下方面降低血小板的污染：

①　在较低的离心力情况下（比如 200 g）进行离心处理，血小板密度比较低，会留在血浆中，PBMC 在沉淀里。通过这一操作可以除掉一部分血小板。

②　增加分离后的洗涤步骤；

③　不管用哪种离心管，保持样品的高度/ficoll的高度比为3/2.4，这一点需要严格遵守。  

④　取目的层样品时，需要先将上层溶液去掉，再吸取目的层。

⑤　注意离心温度在 18-20℃，另外考虑血液样品本身是否是正常的血样。

NO.2 Ficoll-Paque PLUS 分离人外周血中的淋巴细胞，为何出现红细胞等污染？

①　可能由于温度太低。在低温下，Ficoll-Paque PLUS 的密度较大，红细胞凝集较少，因此粒细胞和红细胞被阻止进入Ficoll-Paque PLUS层。应将温度增加到 18-20℃；

②　可能离心速度太慢和/或离心时间太短。必须采用适当的时间和离心力，以确保非淋巴细胞完全沉淀。

NO.3 Ficoll-Paque PLUS 分离人外周血中的淋巴细胞，为何淋巴细胞低产量且低活力 ？

可能是由于温度太高造成。在高温下，Ficoll-Paque PLUS 的密度较小，一些淋巴细胞可能穿透 Ficoll-Paque PLUS层。因此，细胞活力也必然会受到影响。应将温度降低到 18-20℃。

NO.4 Ficoll-Paque PLUS 分离人外周血中的淋巴细胞，为何淋巴细胞产量低但活力正常 ？

未用平衡盐溶液将血液稀释到 1:1；通常情况下，红细胞比容较高。高细胞密度导致大量的淋巴细胞陷入红细胞团块中。应进一步稀释血液样品。

NO.5 Ficoll-Paque PLUS分离人外周血中的淋巴细胞，为何淋巴细胞低产量且粒细胞污染增加？

可能是由于离心机转子振动，导致梯度混合。离心机转子振动可能导致淋巴细胞带的增宽，与下层细胞混合。应检查转子是否已适当平衡。选择合适的转速，以避免自发共振频率。

NO.6 Ficoll-Paque PLUS分离人外周血中的淋巴细胞，为何淋巴细胞产量低 、活力低且出现其它类型细胞污染？

可能是由于样品含有非正常密度的细胞；这些细胞的密度不同于那些来自正常人血液中细胞的密度。可能遇到病态血液样品、非人血液样品，或来自外周血之外的来源的样品。Percoll 可能比 Ficoll-Paque PLUS 更加适合此类分离。