Fixable Viability Dye 死活细胞鉴定染料

一、为什么要进行细胞细胞鉴定？

▶ 死细胞带来非特异性染色

▶ 会导致背景增高，影响检测数据的灵敏度

▶ 死细胞染色影响正常的结果比例

二、Fixable Viability Dye（FVS）与传统染料PI/7-AAD有和区别？

1. PI、7-AAD的问题

▶ PI、7-AAD的染色通常是放在其他抗体孵育完成后进行，不能洗涤即要上机检测；

▶ 对于胞内抗体的染色，由于经过了固定步骤，经过PI或7-AAD染色后所有的细胞都是阳性，所以它们只适合胞膜染色的死活细胞鉴定。

▶ 而PI、7-AAD与常用染色通道PE PerCP是同一检测通道，二者只能选择其一使用。PI和7AAD发射谱很很宽，488 nm蓝色激光发射基本上580BP和690BP都被占用，这样大大减小了多色试验中的配色和调补偿的难度

2. Fixable Viability Dye的优点是：

▶ 固定、破膜以及洗涤步骤不影响Fixable Viability Dye的染色

▶ Fixable Viability Dye的光谱多样，适合各种染色组合的搭配。FVS系列有多种，分别对应不同的激光器，发射出不同波长的光，而且发射谱很集中。

三、Fixable Viability Dye使用原理
FVS为氨基反应性染料，与细胞表面或者内部的蛋白不可逆的结合。FVS是染细胞表面或膜内侧的游离胺，活细胞弱阳，死细胞强阳。正是由于和PI 、7-AAD原理不同，所以对于一些需要固定破膜步骤的试验FVS一样适用，如果固定破膜后细胞发生死亡，该染料还是能反应细胞的死活情况，这点是核酸染料所不能替代的。

实验原理图：

四、Fixable Viability Dye使用步骤

实验室前准备：收到货物低温保存，避免反复冻融。 使用前将FVS死活染料的冻干粉产品，加入260ul新鲜配制的二甲基亚砜(DMSO，SigmaD2650），恢复至室温。重复涡旋保证充分溶解。溶解后可以进行分装，在溶解后90天内使用完毕。

保存温度：冻干粉-80度保存，DMSO溶解后-20度保存。

1、 将Fixable Viability Dye先平衡至室温；

2、 用不含叠氮钠、血清及蛋白的PBS将细胞洗两遍；

3、 用1ml PBS（不含叠氮钠、血清及蛋白）重悬细胞，至1-10^6/ml的浓度。

4、 加入1ul Fixable Viability Dye，立即涡旋混匀；

5、 2-8℃ 避光孵育30分钟；

6、 用PBS或者流式染色缓冲液洗1~2遍；

7、 固定、破膜进行胞内染色

 

实验结果图：

四、订购产品清单：

货号	产品名称	规格
562247	BD Horizon Fixable Viability Stain 450	0.1mg
564406	BD Horizon Fixable Viability Stain 510	0.1mg
564407	BD Horizon Fixable Viability Stain 520	0.15mg
564405	BD Horizon Fixable Viability Stain 660	0.1mg

 

	FVS450	FVS510	FVS520	FVS660
激发波长	404nm	408nm	498nm	649nm
发射波长	448nm	512nm	521nm	660nm
激光器	405nm紫色激光	488nm蓝色激光	488nm蓝色激光	633nm红色激光
替代 荧光染料	V450, BV421 Pacific Blue™	V500, BV510	FITC, Alexa Fluor 488	APC, Alexa Fluor 647