优宁维推荐|MSD应用-呼吸道过敏原

过敏性致敏通常通过皮肤点刺试验（SPT）或用ImmnoCAP测定血样中的特异性免疫球蛋白（IgE）水平来评估分析，分开测量每个过敏原和样本。本文探讨了用高通量方法研究呼吸道过敏的可能性，即Meso Scale Discovery（MSD）多重免疫分析法，测量低血容量中的IgE水平。使用Radim诊断的标准品和过敏原验证和优化MSD多重免疫分析的开发，并与SPT和ImmnoCAP对照验证。18名成人（15名呼吸道过敏患者和3名对照）在同一小时内进行采血和SPT。Pearson相关分析和Bland-Altman分析表明，除了屋尘螨外，MSD多重免疫测定法与SPT和免疫帽测定法具有很高的可比性。与SPT和ImmunoCAP试验相比，MSD多重检测对大多数过敏原的敏感性≥78%。此外，MSD多重免疫分析的特异性≥87%——大多数显示100%的特异性。与SPT相比，只有黑麦过敏原的特异性较低，可能是由于交叉反应。MSD多重免疫分析的可重复性，评估为不同取样时刻之间的组内和组间可重复性和生物变异性，对于所有受试者（受试者13除外；r=0.65–0.99）显示出显著的高相关性（r=0.943–1）。MSD多重免疫分析法是一种可靠的方法，可以通过多重和高通量的方式，使用手指穿刺的血样来检测针对呼吸道过敏原的特异性IgE水平。

 

 

呼吸道过敏是世界范围内最常见的过敏，其发生频率和严重程度仍在增加。世界卫生组织估计，2013年过敏性哮喘患者为2.35亿，2006年过敏性鼻炎患者约为4亿。尽管全球范围内呼吸系统过敏患者的数量急剧增加，但在西方国家增加最多。Blomme等人对2320名佛兰芒参与者（年龄3-86岁）进行了皮肤点刺试验（SPT），报告了30.9%的病例中一种或多种常见空气过敏原和临床过敏性鼻炎症状的SPT阳性率为40.3%。欧洲过敏与临床免疫学学会（EAACI）在2015年报告说，全世界高达40%的人口受过敏性鼻炎影响，其中北半球发达国家的患病率最高，欧洲受影响人口为23–30%，美国为12–30%。值得注意的是，受过敏影响的绝大多数人是儿童和年轻人。为了强调患病率的增加，根据比利时健康状况报告，比利时15岁以上人口中自我报告的过敏患病率在2008年为13.3%，2013年为14.2%，2018年为18.7%。虽然变应性鼻炎的发病率并不高，但变应性哮喘的发病率却很高。此外，由于对生活质量和治疗费用的影响，这两种类型的呼吸道过敏都给社会带来了负担。快速准确的诊断以确定致敏原对于建立最适当的治疗至关重要。

 

 

结果采用三种方法测定17例患者的过敏（IgE）水平。绿色：皮肤刺试验SPT阳性。黄色：ImmunoCAP阳性。红：MSD多重免疫分析阳性。灰色：阴性结果。CS：报告了过去12个月的临床症状。CS*：过去报告的临床症状。

 

除了病史和临床检查外，寻找免疫球蛋白（IgE）致敏是诊断与过敏相关的主诉的一个重要步骤。数据表明，超过50%的过敏性患者是多重致敏的，这使得诊断更具挑战性。传统上有两种方法：在体内进行SPT或在体外检测血液中的sIgE。过敏性血液试验有几种类型，其中放射过敏吸附试验（RAST）最初是首选的血液试验，但已被更敏感的荧光酶标记试验所取代。本研究特别使用了ImmunoCAP方法学，因为该方法目前最常用于临床实验室的过敏试验。标准贯入试验是快速和结果是立即知道的，但它需要训练有素的临床人员来执行。尽管SPT具有敏感性、微创性和成本效益，但体外方法如ImmunoCAP和酶联免疫吸附试验（ELISA）具有一些优势，包括直接定量和长期保存标本的可能性。尽管如此，体外试验仍存在一些局限性，这些局限性阻碍了大型研究和几年内进行的前瞻性研究。例如，每种过敏原和样品的测量必须分开进行，这很费时，因此与更高的成本和增加技术错误的可能性有关。比较上述两种试验方法的研究，SPT似乎更敏感（假阴性结果更少），而sIgE免疫分析似乎更具特异性（假阳性结果更少）。

 

 

在过去的十年中，有一个逐步发展，从执行单一复合物向多重免疫分析。与单重免疫分析相比，这些多重免疫分析具有许多优点，包括以较低的费用提高效率，所需的样本量较低，从儿科的角度来看更有趣，每个样本量的产量（评估的标记物数量）更大，预测更详细诊断的吞吐量更高，从而促进个性化医疗。目前，各种单一和多重免疫分析可用于研究呼吸道过敏相关免疫蛋白标记物。在这项研究中使用了MSD（美国马里兰州洛克维尔的Meso Scale Discovery）多重免疫分析法（超敏多因子电化学发光分析仪：SQ120 & S600），考虑到这种方法确保了上述所有优点，只需要25µl的血清体积进行分析。这一特殊优势再怎么强调也不为过，因为从儿童身上采集血液样本仍然是一项要求很高的技术，而且是一个道德敏感的问题。使用MSD多重免疫分析法，手指穿刺足以收集足够的样本量来进行测试。同样，生物监测研究也可以受益于这一优势。此外，MSD多重免疫分析法是一种高度灵活的方法，因为过敏原面板可以根据患者的个人需要进行更改。单个过敏原和过敏原混合物都可以在一个完整或部分96孔板上发现，这使得该试验对于个体诊断或生物监测研究更具吸引力。新技术，如ImmunoCAP快速定点护理，可以在儿童和成人身上进行，仍然需要110µl的样本量。此外，这种技术是不灵活的，因为它通过一个固定的过敏原面板操作。另一种最新的多重技术是基于微芯片技术的免疫固相过敏原芯片（ISAC）分析。ISAC分析的主要缺点包括半定量结果和禁食4小时的要求。ImmunoCAP（快速）分析、ISAC试验和MSD多重免疫分析之间的比较见支持信息表S1。

 

到目前为止，临床环境中用于体外试验的多重免疫分析的验证是有限的。在这方面，本研究旨在探讨MSD多重免疫分析法诊断呼吸道过敏的可能性，同时将此方法与SPT和ImmunoCAP分析法进行比较。单一过敏原提取物和过敏原混合物均在MSD多重免疫分析中进行了测试，因为过敏原混合物的使用对于生物监测或分子流行病学研究中的快速筛选目的可能是有趣的。统计分析显示MSD多重免疫分析法和ImmunoCAP分析法具有很高的可比性。这两种测试在敏感性和特异性方面似乎都是可靠的。此外，还测定了MSD多重免疫分析法的重现性，包括不同取样时刻之间随时间的组内和组间变化以及重现性。再现性参数建立了显著的高皮尔逊相关。最后，一个较短版本的方案，包括2小时，而不是与样本过夜孵育，在采血后8小时内提供结果。

 

 

MSD immunoassay

The MSD multiplex immunoassay was used to measure the total IgE as well as specific IgE levels. This method is based on the U‐plex protocol of MSD (Meso Scale Diagnostics) , but was adapted specifically for IgE measurements, using biotinylated allergens, total IgE capture antibody and IgE standards from Radim Diagnostics (Freiburg im Breisgau, Germany).

The standard curve solutions were prepared on the same day that the plate was run by diluting a stock of total IgE (Radim Diagnostics) with diluent 43 (Meso Scale Diagnostics) to 100, 33·33, 11·11, 3·70, 1·23, 0·41, 0·10 and 0 IU/ml.

Specific IgEs against either one particular respiratory allergen or a mixture of various respiratory allergens were tested with the MSD assay. Common respiratory allergens were included, as shown in Table 1.

 

A food allergen mixture which can cause anaphylactic reactions with respiratory symptoms was also included (i.e. the mix for nut allergens). The assay is based on the binding of specific IgEs of the serum samples to the biotinylated allergens. The individual allergens and mixtures of allergens were tested on separate plates.

Plate preparation to assess sIgE

To perform the MSD assay, a U‐plex 96‐well (10‐spot) plate was used. Each well contains 10 individual spots and each spot can be linked to a different biomarker with specific linkers (see graphical abstract and MSD U‐plex product documentation for more information on the linker binding). Per test, one of the 10 spots in each well was used to detect the total IgE, which was necessary to construct the standard curve. It is possible to run a partial plate; however, the protocol described below states the volumes for a full plate. First, nine specific single allergens (to measure sIgEs) and an anti‐IgE capture antibody (to quantify total IgE) were coupled to one of the 10 different linkers by adding 200 µl of the biotinylated allergen/capture antibody to 300 µl of the chosen linker containing a streptavidin binding site. All linker‐solutions were incubated for 30 min at room temperature while shaking. Then 200 µl stop solution (Meso Scale Diagnostics) was added to prevent further binding and incubated for another 30 min. Afterwards, 600 µl of all 10 linker‐allergen/antibody solutions were combined into a single tube. Next, 50 µl of this solution was pipetted into each well to coat the spots on the plate with the appropriate allergen, followed by 1 h of incubation and the detection of the sIgE levels was performed as described below (Detection of sIgE levels).