手把手课程之IHC关键操作步骤，本期品牌：CST

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本文重点讲述IHC操作流程中的关键步骤,并提供数据以支持及解释CST在实验过程中所提的建议（石蜡切片）。最后,本指南列出了CST 科学家内部常用且最适用于与抗体配套使用的IHC试剂。

抗原修复—热诱导的抗原表位修复 (HIER)

缓冲液

适用于HIER 的缓冲液有多种。而CST 常推荐的两种缓冲液是：pH6, 10mM 柠檬酸盐缓冲液和pH 8, 1mM EDTA 缓冲液。缓冲液是否适用于您的实验取决于您所使用的一抗。请查阅产品说明书中所推荐的用于特异性抗体的修复缓冲液。一般而言，EDTA 缓冲液适用于多数磷酸化酪氨酸特异性抗体，而柠檬酸盐缓冲液适用于其他多数抗体。每天都需制备新鲜的1X溶液。

煮沸装置

载玻片在所推荐的缓冲液中加热煮沸一段时间后，才可引起抗原修复。该步骤通常在微波炉或高压锅中进行。虽然，一些研究人员也使用水浴锅，但是，因为该步骤中所选择的装置对染色存在积极或消极的影响。所以，我们建议使用微波炉或高压锅加热煮沸以达到最佳抗原修复效果。

免疫染色

封闭

在IHC–P中，我们建议在室温下在含有Tween20 的TBST 缓冲液和 5% 正常山羊血清 (NGS) 中封闭样品，时长1小时，以防止非特异性背景染色。

在进行IHC–F时，在含有 0.3% Triton. X–100 的1X TBS 和 5% NGS 中封闭样品。市售的含有酪蛋白的封闭溶液与磷酸化的一抗结合后易减弱信号；因此，我们建议不使用含有酪蛋白的封闭剂进行磷酸化特异性抗体的检测。

以上针对封闭步骤所提建议均是在以SignalStain. Boost IHC Detection Reagent 作为检测试剂的情况下提出的。如果选择使用其他检测试剂，我们则建议使用与二抗来源相同的血清进行封闭。

一抗孵育

抗体稀释液

在IHC–P中，有多种抗体稀释液可供选择，但是所选择的抗体稀释剂对染色效果具有显著影响。在CST，我们利用SignalStain.抗体稀释液、TBST/5% NGS（含5%山羊血清的TBST）或者 PBST/5%NGS(含5％山羊血清的PBST)来稀释一抗。因为合适的稀释剂具有抗体特异性；因此，查阅产品说明书中针对使用的抗体所推荐的稀释剂。在进行IHC–F过程中，一抗应在封闭缓冲液(TBS/0.3%Triton. X–100/5% NGS)中稀释。

检测

检测系统

传统的IHC 检测方法利用了亲和素和生物素间的天然亲和性。这种亲和素–生物素–复合物 (ABC) 系统需要进行两步法检测：包括结合生物素化二抗后暴露于亲和素–HRP 复合物，然后进行显色反应。基于生物素的系统容易导致背景染色，特别是含有大量内源性生物素的肝脏、肾脏等组织。

因此，我们建议使用基于聚合物的检测系统，如SignalStain. Boost IHC 检测试剂。该基于聚合物的检测系统不含生物素，而包含了直接偶联于聚合物主链上的酶和二抗。

SignalStain. Boost IHC 检测试剂具有高敏感性并消除因内源性生物素所致的假阳性染色，其检测过程省去一个步骤为检测过程节省了时间，并且其与所有基于过氧化物酶的底物相容。

色原

二氨基联苯胺 (DAB) 底物是基于过氧化物酶检测系统中最常用的色原之一。DAB 与HRP 反应以在抗体结合处形成棕色沉淀物。在实验中建议始终使用高质量的DAB 底物。

在CST 公司，IHC 小组的CST 科学家内部鉴定IHC 抗体所使用的都是SignalStain. DAB底物试剂盒。SignalStain. DAB 底物试剂盒敏感性高，且与一抗的作用效果最佳。在TBST 中清洗 3 x 5 分钟（若为IHC–F，则在TBS 中清洗 3 x 5 分钟），以清除未结合的二抗，随后将 100–400μl SignalStain. DAB 应用于每一个组织切片并密切监控以得到合适的显色。

一般而言，1–10 分钟即可获得可接受的染色强度。获得合适的染色强度后，将载玻片置于蒸馏水 (dH2O) 中以阻止进一步显色。

CST的IHC/IF明星产品推荐

生化试剂：

Catalog Number	Product Name	Product Type	Size	Application
11932S	Image-iT® FX Signal Enhancer	Buffer	10ml	IF-P IF-F IF-IC
12388S	BackDrop® Green Background Suppressor	Buffer	2.5ml	IF-IC
14177S	SignalStain® Mounting Medium	Buffer	60ml	IHC-P
14746S	SignalStain® Citrate Unmasking Solution (10X)	Buffer	125ml	IHC-P
14747S	SignalStain® EDTA Unmasking Solution (10X)	Buffer	125ml	IHC-P
15019S	Animal-Free Blocking Solution (5X)	Buffer	25ml	W IHC-P
5425S	Normal Goat Serum	Buffer	10ml	IHC-P IHC-F IF-P IF-F IF-IC ICW
8112S	SignalStain® Antibody Diluent	Buffer	25ml	IHC-P
8961S	ProLong®Gold Antifade Reagent with DAPI	Buffer	10ml	IF-P IF-F IF-IC
9071S	ProLong®Gold Antifade Reagent	Buffer	10ml	IF-P IF-F IF-IC

检测试剂盒：

Catalog Number	Product Name	Product Type	Size	Application
8059S	SignalStain® DAB Substrate Kit	Detection System Kit	1Kit	IHC-P
12692S	SignalStain® Apoptosis (Cleaved Caspase-3) IHC Detection Kit	IHC Kit	1Kit	IHC-P
65713T	PD-L1, CD3ε, CD8α Multiplex IHC Antibody Panel	IHC Kit	1Kit	mIHC
78701T	PD-L1, FoxP3, CD8α Multiplex IHC Antibody Panel	IHC Kit	1Kit	mIHC
8109S	SignalStain® Proliferation/Apoptosis IHC Sampler Kit	IHC Kit	1Kit	IHC-P

二抗：

Catalog Number	Product Name	Product Type	Size	Application
4408S	Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate)	Secondary Antibody	250µl	IF-IC F HCA
4409S	Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 555 Conjugate)	Secondary Antibody	250µl	IF-IC HCA
4410S	Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 647 Conjugate)	Secondary Antibody	250µl	IF-IC F
4412S	Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate)	Secondary Antibody	250µl	IF-IC F
4413S	Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 555 Conjugate)	Secondary Antibody	250µl	IF-IC HCA
4414S	Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 647 Conjugate)	Secondary Antibody	250µl	IF-IC F
4416S	Anti-rat IgG (H+L), (Alexa Fluor® 488 Conjugate)	Secondary Antibody	250µl	IF-IC F
4417S	Anti-rat IgG (H+L), (Alexa Fluor® 555 Conjugate)	Secondary Antibody	250µl	IF-IC
4418S	Anti-rat IgG (H+L), (Alexa Fluor® 647 Conjugate)	Secondary Antibody	250µl	IF-IC F
8114S	SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit)	Secondary Antibody	15ml	IHC-P
8125S	SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Mouse)	Secondary Antibody	15ml	IHC-P
8889S	Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 594 Conjugate)	Secondary Antibody	250µl	IF-IC F
8890S	Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 594 Conjugate)	Secondary Antibody	250µl	IF-IC F

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