免疫染色2-样本制备

1.组织

有两种制备组织切片的方法，一是在最佳切割温度（OCT）基质中快速冰冻（IHC-F，IF-F）；二是进行石蜡包埋（IHC-P）。冰冻样本应在冷冻箱中进行切片，并在载玻片上风干10-15分钟，然后再进行下一步的固定。而对组织切块进行福尔马林固定、石蜡包埋，是IHC-P操作步骤中另一种常见的制备方法。这种方法在进行抗体孵育步骤之前，需要进行脱蜡和抗原修复步骤。

IHC-P：石蜡包埋组织
免疫染色前，需收集组织样品并将其固定于10%中性缓冲福尔马林（NBF）中，以维持细胞形态和抗原表位。利用自动处理机对样品进行脱水，并将样品浸润于固体石蜡。将浸润石蜡的样品置于装有少量液体石蜡的模子中，将其冷却。利用切片机获取厚度为4-6 μm的样品，并将其置于有助于样品粘附的带正电荷的载玻片上。

IHC-F，IF-F：冷冻组织
切片前，应将冷冻组织储存于-80℃的温度下，然后包埋入OCT包埋剂。准备染色时，切片前将组织置于-20 — -25℃环境中15分钟以平衡组织成分。利用切片机获取厚度为6-8 μm的组织切片，并将其置于带正电荷的载玻片上。为进一步帮助样品粘附于载玻片上，我们建议在固定前，将载玻片在室温下风干几分钟，以清除所有的残余水分。

载玻片储存
对于石蜡切片，我们建议使用最新制备的载玻片以获得最佳结果。长时间储存可能导致载玻片样品失去抗原性。该过程会有所不同，视靶点蛋白性质而定。因为蛋白质的载玻片储存对染色的影响不明，所以在使用之前，制备新载玻片是最佳方法。如果载玻片必须储存，对于石蜡切片，则将其储存于4℃的无烘烤环境中；而对于冰冻切片，则可在固定、梯度蔗糖脱水后放于切片冻存盒中保存在-80℃冰箱中。

2.细胞

ICC/IF-IC操作流程的最后一步是在显微镜下观察已固定和已染色细胞的成像。考虑到这一点，一开始必须在可用于荧光显微镜的载体材料上进行细胞铺板（从永生化细胞系中传代培养，或从原代细胞中分离）。典型的载体形式包括玻璃底细胞培养皿、使用聚赖氨酸和/或细胞外基质成分制成的玻璃盖玻片（保存在塑料培养皿内，支持贴壁式细胞培养）、市面上可用于显微镜的玻片底多孔盒等。对于悬浮培养细胞系的免疫染色操作方法有二，一是先在悬浮液中进行固定步骤，然后低速离心至载玻片上（离心涂片）进行后续的染色步骤；二是先在悬浮液中进行固定和染色步骤，离心洗脱，然后用移液管移至盒式玻片或多孔器皿上进行成像。

ICC/IF-IC实验中还需注意的一点就是细胞健康状态和细胞密度。培养条件可能会影响细胞的健康状态、形态、靶标抗原的表达/定位，最终决定实验数据的质量高低。定期检查培养基的pH变化，在显微镜上以低放大倍数检测细胞应激迹象（如多核细胞），确保您的细胞始终保持健康状态。此外，还要确保细胞密度对相应细胞类型和靶标而言是适宜的。有些蛋白会受密度影响产生重新定位，比如YAP蛋白（低密度下主要定位在细胞核中，高密度下，则核定位减少，胞质定位信号增加）等。

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