问题/现象

可能的原因

改善方法

无染色

一抗和二抗不匹配

使用抗一抗的二抗（如一抗来自兔，二抗未抗兔抗体）

没有足够一抗与目标蛋白结合

使用低稀释度抗体，延长孵育时间（4℃过夜）

抗体天然结构（3D形态）受损不适用于IHC

用天然（非变性的）WB法检测抗体，确保抗体未受损坏

由于储存不当、稀释或反复冻融造成抗体失效

做阳性对照确认一抗、二抗试剂盒的有效性

靶组织中没有目标蛋白

参照抗体供应商的建议做阳性对照

组织中没有足够的目标蛋白

应用信号放大操作

二抗未避光保存

避免二抗受光照

脱蜡不彻底

延长脱蜡时间，更换二甲苯

固定步骤（使用福尔马林和多聚甲醛固定剂）修饰了抗体识别表位

抗原修复法暴露出抗原表位，缩短固定时间

蛋白位于细胞核内（核蛋白），抗体不能穿透核膜

封闭液和抗体稀释液中加入通透剂

PBS缓冲液被细菌污染，破坏了靶蛋白的磷酸根

于PBS储存液中加入0.01%叠氮化合物，或使用新鲜无菌PBS

高背景

封闭不充分

延长封闭时间，考虑更换封闭剂。建议使用10%正常血清封闭切片1h或1-5% BSA封闭培养细胞30 min

一抗浓度过高

降低抗体浓度，在浓度较低抗体中延长孵育时间

孵育温度过高

4℃中孵育切片或细胞

二抗发生了非特异性结合（被损坏）

增加对照组，排除二抗的非特异性结合可能性

固定剂残留

使用PBS充分清洗

高背景

存在内源性过氧化物酶活性

使用酶抑制剂，如抑制碱性磷酸酶的盐酸左旋咪唑（2mM），或抑制过氧化物酶的H2O2

固定过度（固定剂用福尔马林和多聚甲醛）导致抗体识别抗原位点被修饰

改变抗原修复方法，缩短与抗原修复液的孵育时间

信号过度放大

缩短信号放大时间、孵育时间，稀释信号扩大试剂盒

底物过量（酶检测法）

缩短底物孵育时间

染料与PBS在细胞/组织中相互作用（酶检测法）

用Tris缓冲液冲洗切片后，再与底物孵育。孵育后，Tris缓冲液再次冲洗细胞/切片

通透作用破坏膜并除去了膜蛋白

去除缓冲液中通透剂

非特异性染色

一抗、二抗浓度过高

降低抗体浓度，缩短孵育时间

存在内源性过氧化物酶活性

使用酶抑制剂

一抗与被染组织同源，加二抗后，二抗会与同源的所有组织结合

使用与组织非同源的一抗

切片/细胞变干

保持切片/细胞湿度，切勿变干

问题/现象

可能的原因

改善方法

信号弱或无信号

样品保存不当，荧光基团在光线下暴露时间过长，导致信号衰减

避光条件下进行保存和孵育样品。可在防淬灭溶液中封固样本。样本封固后立即采集图像，以获取最佳结果。

细胞、组织样本保存时间过长

使用新制备的载玻片/板，以避免丧失抗原。

固定不足

建议操作步骤：处理后立即移除介质并在固定剂中快速/彻底地清洗。对于磷酸化特异性的抗体，使用浓度为至少4%的甲醛来抑制内源性磷酸酶。

抗体稀释浓度过低

使用产品册建议稀释浓度。

抗体孵育时间不恰当

使用产品册建议操作步骤进行一抗孵育。

检测系统不适用

在可能的情况下，使用蛋白印迹法或其它方式来确认表达蛋白。

诱导靶蛋白不恰当

针对每种靶标确定各自最佳处理条件和对照。

目标蛋白表达较低

调整检测方法；考虑信号扩增，或与更亮的荧光基团配对。

通透方法不正确

使用产品册建议操作步骤。

二抗适用不当

使用产品册建议稀释浓度使用；检查二抗与一抗宿主的物种匹配。

激发波长适用不正确

确保激发和检测与荧光基团激发光波长相匹配。

多重IHC中信号较弱

优化脱蜡、抗原修复、信号扩增方法。