膜蛋白的获取

膜蛋白在生物体中的表达量非常小，具有天然的疏水性等一些理化性质，导致膜蛋白样品的获取一直以来都是膜蛋白研究的瓶颈问题。而在制备膜蛋白样品时，还需要充分考虑到后续蛋白分析及质谱分析等应用匹配，也给膜蛋白结构和功能研究带来了很大的技术挑战。

1.膜蛋白提取或表达

提取膜蛋白样品即是将蛋白质从膜上分离出来。通过物理或化学方法将细胞或组织破碎，使用梯度离心得到含有膜蛋白的粗组分，再用特殊的去污剂选择性分离膜蛋白。基于去污剂的方法，从细胞或组织样品中提取膜蛋白。

细胞样品：使用刮刀将贴壁细胞刮下（用以膜蛋白提取的细胞样品不建议用胰酶消化处理）或采用离心法将悬浮细胞收集。

组织样品：组织块研磨或匀浆至均一悬浮液，用以进行膜蛋白的提取。

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虽然生物体中有三分之一的基因编码膜蛋白，但是生物膜上的膜蛋白水平很低，因此直接在天然生物环境中难以获得足够量的膜蛋白。优宁维为您提供异源表达系统进行重组蛋白过量的异源表达。对于给定的目标蛋白，需通过实验确定最适合的异源表达宿主，如最常用的大肠杆菌原核表达系统，但其表达的重组蛋白常以包涵体形式存在，无法直接应用于三维结构的研究。

▶重组蛋白表达：

膜蛋白的生物体内合成包括两个部分：蛋白质的表达，以及后续的生物膜上定位和装配，而异源表达难以实现膜蛋白的定位与装配。也有不受细胞生命活性影响的表达体系，如无细胞蛋白质合成体系(cell-free protein synthesis system, CFPS)，可以避免异源表达存在的以上问题。

2.膜蛋白纯化

重组膜蛋白常会表达于质膜上或包涵体内。将表达于质膜上的、含有融合亲和标签的重组膜蛋白，利用合适的去污剂从质膜上溶解,再使用亲和层析柱或亲和介质吸附游离的膜蛋白进行亲和纯化试验，其纯化步骤同可溶蛋白质的亲和纯化步骤基本相似。

▶亲和柱纯化蛋白：

膜蛋白与水溶蛋白最大的差别在于膜蛋白是不溶于水的，需要借助于去污剂 (即表面活化剂) 使原本脂溶性的膜蛋白变成水溶性的膜蛋白-去污剂复合体，从而进行膜蛋白纯化。因此去污剂的选择对膜蛋白样品获取具有至关重要的影响作用。

去污剂主要包括三大类：离子型去污剂、非离子型去污剂和两性去污剂。寻找最适合的去污剂一般需要进行筛选实验，理想的去污剂应该使膜蛋白有效地与生物膜分离，同时避免目标膜蛋白变性。如离子型去污剂（SDS等）会与膜蛋白发生相互作用，使膜蛋白变性，因而不利于后续的膜蛋白结构研究；非离子型去污剂（DDM等）作用温和，常用于膜蛋白的纯化；两性去污剂（LDAO等）对膜蛋白的变性作用较离子型去污剂弱，可用于从细胞膜中提取膜蛋白。

▶去污剂产品：

而重组膜蛋白表达于包涵体中时,易得到较高的表达量，但是纯化后的蛋白质需要复性步骤以重新进行蛋白折叠恢复原有构象。在复性的过程中，涉及多种影响蛋白质结构稳定的因素，优宁维为您提供的膜蛋白复性试剂，用来使表达于包涵体的膜蛋白在纯化后恢复其原有构象。

▶蛋白质复性：