IF常见问题

可能原因

建议

1、目的蛋白需要诱导表达或者表达量低

对于需要诱导表达的蛋白，参考文献找到诱导蛋白表达的最佳处理条件和阳性对照；表达量低的蛋白考虑信号扩增，或与更亮的荧光基团配对；在可能的情况下，应使用蛋白印迹法或其他方法来确认蛋白表达情况。

2、样本保存不当。如荧光基团在光线下暴露时间过长，可能会导致信号衰减。

在避光条件下进行孵育和保存样本。可在防淬灭的溶液中封固样本，比如ProLong® Gold Antifade Reagent #9071。样本封固后要立即采集图像，以获取最佳结果。

3、细胞/组织样本保存时间过长

使用新制备的样本载玻片/板。

4、固定不足

请参见CST产品说明书中建议的操作步骤；处理后立即移除介质并在固定剂中快速、彻底地清洗。对于磷酸化特异的抗体，使用浓度为至少4%的甲醛来抑制内源性磷酸酶。

5、抗体用量不合适

参见说明书建议的抗体稀释浓度，并根据样本表达量进行摸索。

6、一抗孵育时间不合适

CST抗体在4°C过夜孵育时可获得最佳结果。

7、错误的通透方法

参见产品说明书中建议的操作步骤。

8、二抗使用不当

按建议浓度使用，检查二抗是否与一抗的宿主物种相匹配。

9、错误的激发波长

确保激发和检测（激光/激发/发射滤光器）与荧光基团激发光波长相匹配。

原因

解决方案

1、封闭不充分

使用与二抗相同物种的正常血清，封闭1h。

2、抗体使用浓度过高

参考说明书推荐浓度，并根据蛋白表达量进行优化。

3、抗体孵育时间过长或孵育温度过高

参考说明书推荐的孵育时间和温度。

4、样本变干

染色过程中，确保样本始终彻底浸没在液体中。

5、清洗不足

清洗以移除多余固定剂、多余二抗，以及结合松散、非特异性的抗体相互作用。

6、样本自发荧光

以未染色样本为对照，检测自发荧光程度。参考说明书推荐的固定剂，用久了的固定剂可能会出现自发荧光。更换陈旧甲醛、制备新鲜的稀释液。使用在安瓿中新稀释的、可用于电子显微镜（EM级）的戊二醛。为低丰度靶标选择较长的波长通道。

7、非特异性抗体结合

如可能，请与敲低（siRNA）或敲除细胞，或与已知靶抗原表达水平较高或较低的细胞进行比较。