如何做好转染？

导语：
随着分子生物学和细胞生物学研究的不断发展，转染已经成为研究和控制真核细胞基因工程的常规工作。

转染技术是指将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的技术。在研究基因功能，调控基因报答，突变分析和蛋白质生产等生物学试验中，应用越来越广泛。转染根据是否能把外源核酸整合到宿主染色体上分为瞬时转染和稳定转染。

01转染基础

稳转or瞬转？01

瞬时转染：外源性DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一次宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但是通常只能维持几天，多用于启动子以及其他调控元件的分析。一般在24-96小时内分析结果。核酸类型比较广泛，质粒DNA、siRNA、miRNA、和mRNA都可进行瞬时转染。

稳定转染：通过这种转染方式外源性DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体存在。外源DNA整合到宿主染色体中概率很小，大约1/10000转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，得到稳定转染的同源细胞系。稳定转染的核酸多为质粒DNA。

02转染方法比较

磷酸钙法：其原理是借助形成一种DNA-磷酸钙沉淀物，使其粘附于细胞表面，通过细胞的内吞作用而使DNA被细胞捕获。可适用于稳转瞬转，操作简便花费相对较低，但转染效率低，10-20%，并且重复性很差。

电穿孔：电穿孔是通过高强度的电场作用破坏细胞膜电位，瞬时提高细胞膜的通透性，从而吸收周围介质中的外源分子。这种技术可以将核苷酸、DNA 与RNA、蛋白、糖类、染料及病毒颗粒等导入原核和真核细胞内。电穿孔的方式是由于稳转和瞬转，所有细胞都适用，但是细胞致死率非常高，并且对DNA和细胞的用量很大，不同的细胞类型需要优化不同的实验方案，单单是细胞致死率大这一点就非常不适合下游实验。

病毒介导法：通常是逆转录病毒，通过病毒侵染宿主细胞的机制将外源基因整合到宿主细胞的染色体中，构建稳转株。可以用于难转染的细胞，原代细胞，体内细胞等，但携带基因不能太大。

显微注射法：使用精密的仪器，直接将外源性核酸注射至宿主细胞核内。多用于转基因，由宿主基因组序列可能发生的重组，缺失，复制或者异位等现象使外源基因嵌入宿主的染色体中。

脂质体法：就是我们常见的试用转染试剂法，除此之外还有一些转染试剂是其他形式，如树枝状聚合物。

02转染注意事项

核酸质量01

DNA的质量：内毒素通常在质粒制备的裂解中释放出来并与质粒DNA共存，内毒素会导致转染效率显著下降，特别是对内毒素敏感细胞比如原代细胞、悬浮细胞和造血细胞或者想要获得最高的转染效率和最低的细胞毒性。除此之外，在构建表达质粒的时候，有一些基因编码出来的蛋白是对细胞有毒性的蛋白，表达会导致细胞死亡。面对这种情况需选择较弱的启动子或者可以诱导的启动子限制毒性基因产物表达对细胞造成的损害。合理的计算siRNA的浓度：通过合适的阳性对照优化转染和检测条件，使用管家基因作为阳性对照。将不同浓度阳性对照的siRNA转入靶细胞（同样适合实验靶siRNA），转染48小时后统计对照蛋白或mRNA相对于未转染细胞的降低水平。已确认最佳浓度，过多的siRNA会导致细胞毒性甚至死亡。

细胞质量02

细胞密度：细胞密度对转染效率有一定的影响。不同的转染试剂，对细胞密度的要求不尽相同。在进行不同核酸或不同细胞系的转染时，需要再次优化实验条件。根据不同的实验目的对细胞的铺板密度有要求，一般情况下阳离子脂质体会有一定的毒性，所以要求细胞数比较多，但如果在研究细胞周期相关基因等表达周期长的基因，就需要较低的铺板密度，所以需要选择在较低铺板密度下进行转染的试剂。一般转染时贴壁细胞密度为50-90%，需要根据说明书参考。