SPE技术加持，甲基化靶向测序从未如此简单

QIAseq Targeted Methyl Panel甲基化靶向测序解决方案

甲基化是指从活性甲基化合物(如S-腺苷基甲硫氨酸)上将甲基催化转移到其他化合物的过程。可形成各种甲基化合物，或是对某些蛋白质或核酸等进行化学修饰形成甲基化产物。在生物系统内，甲基化是经酶催化的，这种甲基化涉及重金属修饰、基因表达的调控、蛋白质功能的调节以及核糖核酸(RNA)加工 。

其中，基于高通量测序的针对特定靶向区域的甲基化测序技术成为业界教认可的研究方法。但是诸多因素也制约着这一技术的发展，比如靶向技术、检测灵敏度以及亚硫酸氢盐转化（BS）对DNA的损伤等。

QIAGEN推出了基于单端特异性引物延伸技术（Single Primer Extension, SPE）的甲基化靶向测序产品QIAseq Targeted Methyl Panel，在不到8h的时间内即可完成亚硫酸氢盐转化、单链DNA高效连接和靶向文库构建全过程，最低仅需1ng起始DNA（FFPE样品和液体活检中低至10 ng），可实现对gDNA、FFPE-DNA、cfDNA等多种类型样品的甲基化分析。其测序工作过程见下图。

1day，将亚硫酸氢盐转化的DNA转换为可测序的文库

01 单引物扩展（SPE）方法

提高灵敏度

为了测试甲基化程度的准确性和可重复性，使用由749个引物组成的QIAseq Targeted Methyl Panel处理了甲基化程度为0％，50％和100％的40 ng对照DNA。在MiSeq上对样品进行测序，并评估了> 30 UMI覆盖的CpG的甲基化程度，从而获得了准确且高度可重复的甲基化检测结果。

02 FFPE DNA的甲基化状态：甲基化程度

为了测试FFPE DNA的甲基化状态，将QIAseq Targeted Methyl Panel与40 ng输入FFPE DNA一起使用。由93个引物组成的小组覆盖了566个CpG位点。MGMT基因的7个CpG位点的评估甲基化程度与先前用焦磷酸测序验证的甲基化程度高度相关。

即在每条原始模板上引入的特异分子条形码 (Unique Molecular Indices, UMI)，有效解决PCR扩增所带来的偏倚，为检测的准确性、灵敏性及全面性提供了前所未有的保障。以40ng FFPE DNA起始样本进行的甲基化靶向测序结果，与甲基化分析金标准焦磷酸测序技术（Pyrosequencing）相比，不同甲基化水平的多个CpG位点均显示了非常高的一致性。

03 与既定方法高度相关

为了测试与已建立方法的相关性，将QIAseq Targeted Methyl Panel与来自肝细胞的40 ng输入gDNA一起使用。该小组由102个引物组成，涵盖71个CpG。与供应商I阵列相比，甲基化程度导致高度相关。

04 绘图效率

输入> 1 ng

– gDNA

-FFPE

– ccfDNA

结果显示在引物上的高度定位和独特的高度定位。

区别于一般的PCR扩增子技术，SPE能够实现在一个反应管中完成最高2万重的多重PCR反应，而同时保证特异性、均一性依旧可高达95%以上。针对不同样本类型的甲基化靶向文库，即使起始DNA量只有1-10ng，测序结果依旧可以得到极高的mapping率。

甲基化全套解决方案图片
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