小优Details-如何做好NRF2

1、    引言

氧化应激（Oxidative Stress，OS）由于活性氧（自由基）的产生和抗氧化防御之间的平衡紊乱，引起的组织损伤，可导致多种疾病，比如神经系统（帕金森病、阿尔茨海默病）、心血管疾病（高胆固醇血症和动脉粥样硬化、中风、心肌梗塞等）、生殖系统疾病或自身免疫疾病等。NRF2是在OS反应中起关键作用的转录因子。在稳态条件下，KEAP1结合 NRF2，并将其保留在细胞浆内，进行泛素介导的降解，维持较低NRF2水平。少量组成型胞核 NRF2 通过调节抗氧化剂反应基因的基础表达来维持细胞稳态。在OS后，KEAP1 释放 NRF2，从而使激活剂转位到细胞核与抗氧化反应元件ARE 元件基因结合，导致细胞保护基因的表达，比如GSH、HO-1、NADP(H)、NQO1等。

图1 Nrf2与炎症通路的调控（R. Wang，2020）

目前研究氧化应激的老师很多，NRF2鉴于它的特殊性，是其中一个比较难做的指标。做NRF2我们需要注意什么呢？我们接下来仔细分析一下。

2、NRF2的注意事项

a.    WB检测限-细胞中较高的蛋白水平
从HPA（The Human protein Atlas）可知NRF2的在各组织中的基因表达水平尚可，但在稳态下NRF2的实际蛋白水平是很低的，不断地经过泛素-蛋白酶体途径被降解。

图2 NRF2在人源细胞系中的基因表达水平（HPA）

图3泛素-蛋白酶体途径

需要氧化应激/亲电子试剂（如图4左，亚砷酸盐50 μM，8 h,）处理导致(KEAP1) E3 泛素连接酶复合物失活，或者蛋白酶体抑制剂（如图4右，MG132 10 μM，10 h）处理令其不被降解。
 

图4 不同处理NRF2的蛋白表达情况（CST）

b.    翻译后修饰

根据Uniport可查到NRF2有多个翻译后修饰 (PTM)。其中磷酸化Ser40和乙酰化促进其核定位，并易位到核内。糖基化阻止了小 Maf 蛋白的异二聚化，从而削弱转录因子活性。入核后，通过FN3K的去糖作用恢复活性，与Maf形成异二聚体，结合ARE发挥作用。

图5 NRF2的几种修饰和异二聚体的形成

c.    NRF2条带位置的争议

由于抗体生产方面的原因，一直以来许多研究者认为Nrf2是以预测的55-65 kDa 的分子量迁移，该预测是根据 Nrf2 的开放阅读框大小 2.2-kb 做出的。Alexandria Lau在2013年通过化学刺激、哺乳动物过表达和重组蛋白表达提供了证据，证明NRF2实际条带应该在95-110KD。此后抗体厂家也纠正了这个错误，目前标注的实际条带位置都在95-110KD。

图6 Nrf2条带位置的验证

在具体的实验时，有的老师可能会遇到无条带、非特异带、高背景或者条带位置不对的情况。针对这些情况出现的可能原因，小优进行了一一分析，并给出了相应的解决方案。

3、    常见问题的原因分析

a.    无条带：样品未经合适处理；降解或提取不充分；抗体不工作
 
b.    非特异带：样品降解；同型或者修饰；多聚体；漂洗不充分；抗体非特异
 
c.    高背景：样品降解；试剂或操作污染；漂洗不充分；PVDF膜；抗体非特异
 
d.    条带位置不对：样品降解，胶浓度，抗体不特异
 
4、    解决方案

a.    设置阳性对照，选择合适的处理(MG132，氧化应激)作为阳性样品；样品新鲜制备；被Keap1释放后入核，裂解时强烈建议超声处理，或者用专门的核提取试剂盒；增加上样量((细胞20ug，组织50-100ug))；更换抗体。

b.    新鲜制备样品；同型/修饰换其他细胞样品看看；存在异源二聚体，因此loading buffer中还原剂（0.6MDTT或者5%B-ME）要有效，可另外添加；加强漂洗，增加漂洗液中的NaCl 浓度（150mM-500mM）和Tween浓度（0.1-0.5%）；更换抗体。

c.    新鲜制备样品；实验中试剂包括电泳液、转膜液、漂洗液、脱脂奶粉、抗体稀释液等用新鲜配制的，海绵也要洗干净，滤纸换新的，操作时用镊子夹边缘不要用手触摸，孵育时放平，不要弯曲导致孵育不均，膜干掉；加强漂洗，增加漂洗液中的NaCl和Tween浓度；使用NC膜背景会相对低点；更换抗体。

d.    新鲜制备样品；使用梯度胶，排查问题时孵全膜；更换抗体

或者以下表形式排版

常见问题	原因分析	解决方案
无条带/弱条带	样品未经合适处理； 降解或提取不充分； 抗体不工作	1.    设置阳性对照，选择合适的处理(MG132/氧化应激)作为阳性样品； 2.    新鲜制备，被Keap1释放后入核，裂解时强烈建议超声处理，或用核提取试剂盒,增加上样量(细胞20ug，组织50-100ug)； 3.    更换抗体
非特异带	样品降解； 同型/修饰； 多聚体； 漂洗不充分； 抗体非特异	1.    新鲜制备样品； 2.    换其他细胞样品； 3.    存在异源二聚体，loading buffer中还原剂（0.6MDTT/5%B-ME）要有效，可另外添加； 4.    加强漂洗，增加漂洗液中的NaCl 浓度（150mM-500mM）和Tween浓度（0.1-0.5%）； 5.    更换抗体
高背景	样品降解； 试剂/操作污染； 漂洗不充分； PVDF膜； 抗体非特异	1.    新鲜制备样品； 2.    电泳液、转膜液、漂洗液、脱脂奶粉、抗体稀释液等用新鲜配制的，海绵洗净，滤纸换新，用镊子夹边缘不要用手触摸，孵育时放平，不要弯曲导致孵育不均，膜干掉； 3.    增加漂洗液中的NaCl和Tween浓度； 4.    使用NC膜背景会相对低点； 5.    更换抗体
条带位置不对	样品降解； 胶浓度； 抗体不特异	1.    新鲜制备样品； 2.    使用梯度胶，排查问题时孵全膜； 3.    更换抗体

 
无条带/弱条带    样品未经合适处理；

5、NRF2相关抗体

货号	靶点	产品名称
12721	NRF2	NRF2 (D1Z9C) XP® Rabbit mAb
8047	KEAP1	KEAP1 (D6B12) Rabbit mAb
43966	HO-1	HO-1 (E3F4S) Rabbit mAb
8242	p65	NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb
3033	p-p65	Phospho-NF-κB p65 (Ser536) (93H1) Rabbit
5114	p62	SQSTM1/p62 Antibody
9242	IκBα	IκBα Antibody
2859	p-IκBα	Phospho-IκBα (Ser32) (14D4) Rabbit mAb

Reference:
1. Molecular Mechanisms of Nrf2 in Inflammation: Interactions Between Nrf2 and Inflammatory Mediators
2. The Predicted Molecular Weight of Nrf2: It Is What It Is Not
3. https://www.uniprot.org/uniprot/Q16236
4. https://www.proteinatlas.org/ENSG00000116044-NFE2L2/celltype