Science揭示SARS-CoV-2的刺突蛋白三聚体糖基化图谱

严重急性呼吸综合征冠状病毒-2 (SARS-CoV-2)是COVID-19的病原体，可引起发热、严重呼吸道疾病和肺炎，对全球人类健康构成了重大威胁。
病毒的糖基化修饰在病毒生物学中具有广泛的作用，包括介导蛋白质折叠和稳定性以及协助病毒侵染的特性。糖基化位点也可以通过遮挡中和抗体的特异性识别位点来抑制免疫原性和促进免疫逃避，因此识别和研究新冠病毒的糖基化有助于病毒病理学的研究，药物研发和疫苗设计。

2020年5月4日，英国南安普顿大学Max Crispin团队在Science在线发表了一篇题为“Site-specific glycananalysis of the SARS-CoV-2 spike ”研究论文，作者使用了位点特异性的质谱方法，揭示了重组SARS-CoV-2 S蛋白免疫原的糖基化结构。

1、SARS-CoV-2 S糖蛋白的表达与验证
     话不多说，我们先来看一下研究思路与成果：
     为了更好的研究S蛋白，作者构建并表达了重组S蛋白。具体方法如下：
（1） 作者构建了SARS-CoV-2 S蛋白1-1208基因序列质粒，在序列两端加上了TwinStrep标签和8X His标签，使用哺乳动物表达载体pαH。
（2）表达载体瞬时转染到FreeStyle 293F细胞中进行扩增和表达。
（3）蛋白纯化过程先使用了Strep预装柱和His预装柱进行初步纯化。
（4）第二步使用Superose 6 10/300分子筛进行进一步纯化。

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图1 SARS-CoV-2 S糖蛋白的表达与验证

2、确定S蛋白的位点特异性糖基化
     作者使用胰蛋白酶、糜蛋白酶和α蛋白酶生成了三个包含N-糖基化的糖肽样本，通过液相-质谱分析，确认了S蛋白上包含有22个糖基化位点并分析了多糖成分，其中8个为寡糖型，其余14个位点为混合型，表明了SARS-CoV-2 S多糖的加工与宿主糖蛋白不同。
 

图2 SARS-CoV-2 S蛋白的位点特异性糖基化分析

3、绘制SARS-CoV-2 S蛋白多糖图谱
     作者利用三聚体SARS-CoV-2 S蛋白的冷冻电镜结构，在3D结构上定位出了冠状病毒S蛋白的糖基化状态并绘制了S蛋白三聚体糖蛋白图谱。揭示了N-连接多糖是如何遮蔽SARS-CoV-2 S蛋白表面不同区域的。作者还发现，S蛋白上的受体结合位点会被邻近的糖基化位点遮蔽。考虑到受体结合位点的功能性限制和这些残基的低突变率，作者猜测可能病毒利用N-连接多糖来遮蔽最保守和易受攻击的区域。
 

图3  SARS-CoV-2 S蛋白N-连接多糖的定位

     该研究对SARS-CoV-2的S蛋白进行了位点特异性的糖基化分析。基于越来越多的糖蛋白候选疫苗的开发，该研究详细的多糖分析为比较免疫原完整性提供了一条途径，在大规模生产扩大到临床使用的检测过程也起到非常重要的作用，对病毒生物学的研究和疫苗开发都有重大意义。