蛋白纯化“小白”也能轻松发文章

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原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30904445/

研究摘要

Hispidalin是一种从Benincasa hispida的种子中分离得到的新型抗菌肽，对各种细菌和真菌病原体有广泛的抗菌活性。为了获得大量Hispidalin，研究者构建带有N端6×His tag和肠激酶序列的重组Hispidalin，成功在Escherichia coli和 Pichia pastoris cell中表达。结果表明，大肠杆菌来源的重组Hispidalin对所有菌株均无抗菌活性，而Pichia pastoris来源的重组Hispidalin(以下简称rhipidalin)对5种革兰氏阴性和革兰氏阳性病原菌均具有广泛的抗菌谱。研究表明rhipidalin具有抗菌活性，40min内能完全杀死所有金黄色葡萄球菌，也具有较强的热稳定性和PH稳定性，对胰蛋白酶和蛋白酶K具有耐药性，对胃蛋白酶和木瓜蛋白酶敏感度较弱，此外，rhipidalin能有效的渗透细胞膜，破坏细菌细胞的形态，经过初步优化，rhipidalin产出浓度高达98.6 µg/ml，这个结果表明rhipidalin可以被P. pastoris细胞大量生产，并且rhipidalin作为一种新的抗菌剂具有巨大的潜力和发展前景。

研究内容

1.  细菌来源的重组Hispidalin的表达、纯化及抗菌活性研究
Fig. 1A.是表达融合肽基因的核苷酸序列和预测的氨基酸序列，该研究利用0.2 mM IPTG诱导大肠杆菌BL21后，获得一条分子量约为32 KDa的蛋白条带，表明重组GST-Hispidalin在大肠杆菌中成功表达，获得重组的肽段利用亲和层析法进行纯化，用抑菌圈实验对纯化的细菌来源的Hispidalin和无GST标记的Hispidalin单体进行抑菌活性检测，结果显示它们都没有抑菌活性，即大肠杆菌可能不是一个生产均有抑菌功能活性Hispidalin的“工厂”。

Fig. 1. (A) The Hispidalin nucleotide sequence and its corresponding amino acid sequence

2. 酵母来源的重组Hispidalin的表达、纯化及抗菌活性研究
经过电击和梯度筛选，通过PCR确认了8个含有rhipidalin编码序列的转化子（见Fig. 1B，Lane M:DNA marker，Lane P: pPICZ αA-Hispidalin阳性对照，Lane N: pPICZ αA-containing GS115细胞阴性对照，Lanes 1-8是抗博来霉素转化子），随机选取一个转化子，在28℃下用1.5%纯甲醇连续诱导表达144h，为了验证酵母表达的rhipidalin的抗菌活性，收集培养96h上清液做抑菌圈的检测，Fig. 1C是L. monocytogenes (A TCC 21633)和B. subtilis L300-1抑菌圈实验，结果表明rhipidalin有较明显的抑菌效果。

Fig. 1. (B) rHispidalin-positive transformant screening by colony-PCR (C) Inhibition zone assay

Fig. 2. Effects of induction time and methanol concentration on rHispidalin expression.

此外，该研究也验证了诱导后培养上清rHispidalin的表达，不同的诱导时间（24、48、72、96、120和144 h）下均出现一条6.5至14.4 KDa之间蛋白条，该条带近似于预测的分子量为7.9 KDa，这个结果表明rHispidalin在P.pastoris GS115细胞中成功表达（Fig. 2A）。

Fig. 2B是不同的诱导时间下，P . pastoris细胞分泌的rHispidalin表达水平，结果显示诱导时间为24h开始，rHispidalin表达开始上升，96h达到峰值，浓度为98.6µg/ml，因此，优化培养时间是96h。Fig. 2C（Lane M：marker，Lanes 1-4：培养上清（18 µl），用0.5、1.0、1.5和2.0 % (v/v)纯甲醇诱导，诱导时间96h），Fig. 2D是诱导时间96h，不同浓度的诱导剂甲醇的作用下，rHispidalin表达水平，Fig. 2C和Fig. 2D的结果表明优化后诱导剂甲醇的浓度为1.5%。上述结果表明，P . pastoris细胞是一个合适生产rHispidalin的“工厂”。

3.  rHispidalin的纯化及抗菌谱和能力测定
为了研究rHispidalin的抑菌能力，P . pastoris G115培养在28°C, 220 rpm，pH 6.0，用1.5% (v/v)甲醇诱导96小时，取上清提取rHispidalin蛋白，用亲和层析柱Ni Sepharose™ 6 Fast Flow纯化 。Fig. 3. (A)是用梯度浓度的咪唑洗脱得到的纯化rHispidalin，结果说明500 mM的咪唑能有效洗脱rHispidalin,500ML的细胞培养液，最终得到纯度为90.7%、约10.2 mg的rHispidalin。Fig. 3. (B)是利用rHispidalin作用于体外培养的金黄色葡萄球菌检测其杀菌能力，图中分为三组，空白对照（黑色曲线），金黄色葡萄球菌与rHispidalin（浓度为4×MIC）共孵育（红色），金黄色葡萄球菌培养基中加入50 µg/ml庆大霉素（绿色），rHispidalin不仅能抑制细菌生长，还能杀死细菌。

Fig. 3. (A) Silver-stained Tricine-SDS-PAGE to visualize rHispidalin purified in P . pastoris (B) Killing kinetics of rHispidalin against S. aureus (A TCC 25923) in vitro

4.  rHispidalin的溶血活性
Fig. 4是rHispidalin作用于人类红细胞和小鼠红细胞，检测其溶血活性，当rHispidalin浓度为100µg/ml时，没有明显的溶血活动，而当浓度升高至300µg/ml，溶血率仍然低于2%。小鼠红细胞溶血活性检测得到相似的结果，因此该结果表明rHispidalin对高级动物红细胞的溶血活性较低。

Fig. 4. Hemolytic activity of rHispidalin against (A) human erythrocytes and (B) mouse erythrocytes

5.  rHispidalin对pH、温度和蛋白酶的稳定性研究
为研究rHispidalin的稳定性，采用不同pH值、不同温度、四种蛋白酶消化的方法，测定了rHispidalin对金黄色葡萄球菌(S. aureus, TCC 25923)的抑菌活性。温度范围设置为4至100℃，溶解在pH值为2至10的溶液中，Fig. 5A, B结果显示rHispidalin与未处理组有相似的抑菌效力，说明rHispidalin具有较高的热稳定性，在较宽的pH范围内具有较高的稳定性。Fig. 5C是在37℃下用不同的蛋白水解酶处理2 h后，可以清楚地观察到抑菌圈直径的变化(图5C)。rHispidalin对胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的抑制圈直径分别下降到未处理组的60%和50%，说明rHispidalin对胃蛋白酶和木瓜蛋白酶敏感，而对胰蛋白酶和蛋白酶K不敏感，综上所述，rHispidalin对pH变化、温度冲击和蛋白酶消化均有不同程度的耐受性。

Fig. 5. Effects of temperature, pH and proteinase treatments on the antibacterial activity of rHispidalin against S. aureus  (ATCC 25923).

6.  扫描电子显微镜(SEM)分析
通过扫描电镜观察rHispidalin对金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)和大肠杆菌(ATCC 35150)表面形态的影响，以确定rHispidalin的抗菌作用模式。Fig. 6A是用PBS、1×MICrHispidalin和4×MICrHispidalin处理金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)和大肠杆菌(ATCC 35150)，结果显示PBS处理的细菌细胞表面正常、光滑、完整，金黄色葡萄球菌细胞在1×MICrHispidalin和4×MICrHispidalin处理后出现褶皱，大肠杆菌(ATCC 35150)细胞经处理后表面粗糙，有许多明显的凹痕。

Fig. 6. (A) Morphological changes of S. aureus (ATCC 25923) and  E. coli  O157 (ATCC 35150) treated with PBS, 1×MIC Hispidalin or 4×MIC Hispidalin.(B)  Fluorescent microscope analysis of propidium iodide (PI) uptake during the membrane permeabilization assay

7.  细菌膜破坏活性测定
Fig. 6B是荧光显微镜分析膜透性试验中碘化丙啶(PI)的摄取情况,DIC-PBS:PBS处理细菌细胞的光镜图像,红色的PBS和4×MIC分别代表用PBS和4×MIC rHispidalin处理的细菌细胞的荧光图像，从结果看与PBS处理的细菌细胞相比，rHispidalin处理的金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)和大肠杆菌(ATCC 35150)细胞的胞质PI显著增加，表明rHispidalin可以渗透大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的胞质膜，这一结果与扫描电镜(SEM)的结果一致，提示rHispidalin介导的膜破坏机制可能是其抗菌能力增强的重要原因。

技术路线