BIAcore助力PROTAC研发和药理学检测

最近超火的PROTAC技术，你追了嘛？据不完全统计，国内已有20余家药企公司在布局和研究PROTAC，巨头辉瑞更是宣布投入了6.5亿的预付款投入PROTAC研发。业界认为PROTAC具有的能够使靶点从“无成药性”变成”有成药性”的优势，将会掀起小分子药物的新一轮革新。

什么是PROTAC

PROTAC，全称为proteolysis-targeting chimeras，是一种杂合双功能小分子，可以分别招募目标蛋白和E3连接酶。形成的目标蛋白/PROTAC/连接酶三元复合体可以引起目标蛋白的泛素化和降解。

PROTAC示意图

近年来小分子药物一直处于高速的筛选和合成中，为癌症治疗做出了巨大贡献。然而，由于小分子药物的频繁使用，药物耐受性逐渐产生，研究发现有些小分子药物会引起蛋白的聚集，而且有些蛋白由于突变很难发现药物靶点。因此，PROTAC技术的出现很好的转变了小分子药物研发的困局。PROTAC技术可以用来标记各种各样的蛋白，包括转录因子，骨架蛋白，酶和调节蛋白，在癌症研究和神经性疾病的研究中，PROTAC技术得到了巨大的关注。

基于peptide的PROTAC示意图

基于小分子的PROTAC示意图

PROTAC与BIAcore

在PROTAC研发和验证的过程中，BIAcore技术得到了充分的应用。BIAcore技术利用了SPR原理，由于其无标记，实时监测，高灵敏度等特点，在药物研发和筛选中得到了广泛的应用，可以提供蛋白与蛋白，蛋白与小分子，抗原和抗体之间亲和力，动力学，浓度等多种高质量的参数，有效弥补了其他方法需要标记，半定量，灵敏度不高，低通量，以及不能有效提供亲和力动力学参数等问题，也是国内外药企公司通用的技术。

PROTAC设计中，三元复合物之间的协同性，亲和力以及复合物的稳定性是研究重点。在文献“SPR-Measured Dissociation Kinetics of PROTAC Ternary Complexes Influence Target Degradation Rate”中，作者使用了BIAcore方法对目标蛋白（bromodomain-containing target proteins），PROTACs和E3连接酶VHL（von Hippel−Lindau E3 ligase）进行实验和测定。

通过把E3连接酶作为配体偶联在芯片上，我们可以通过这个一个芯片检测多种多样的PROTAC/目标蛋白的结合。为了使芯片表面的表现更加统一，作者对E3连接酶进行改进，设计了一个VHL/ElonginB/ElonginC（VCB）结构，并且在ElonginB的C末端加上AviTag标签，使它带有一个位点特异性的生物素化。

使用Biacore T200仪器和SA芯片，作者设计了一系列浓度的PROTAC或者PROTAC和近饱和浓度的目标蛋白的预混物的亲和力和动力学参数（Fig. 1）。为了实现近饱和浓度，使用的目标蛋白的最小浓度是2uM（corresponding to approximately a 20- to 50-fold excess of binary KD of the PROTAC for the target protein to ensure at equilibrium ≥95−98% formation of binary complex）。

Fig.1 实验设计

作者首先用PROTAC MZ1进行实验体系的验证。PROTAC MZ1和VHL，Brd4BD2形成高结合性的三元复合物。除了MZ1，作者还选择了其他三个PROTACs参与验证（Chart 1）。

作者用Biacore验证了MZ1，AT1，MZP55和MZP61单独（双复合物）以及他们和Brd4BD2的三元复合物的结合数据，并用ITC作为对照（Table 1）。对于MZ1，三元复合物的形成也用其他的BET bromodomains进行测定（Table1 and Fig.2）。

Fig.2 实验测定

和二元复合物相比，VHL/MZ1/Brd4BD2三元复合物表现出更快的Kon和更慢的Koff，从而得到更小的亲和力KD和显著的协同性。

作为对照可以发现MZP55和MZP61三元复合物具有非常快的解离，反映了负协同作用。

综上我们可以发现Biacore可以提供更高的通量，更节约成本，并且可以得到详尽的动力学参数，包括三元复合物的解离半衰期。这些信息对于更好的理解PROTAC功能和三元复合物的稳定性都是非常有价值的，例如对抑制物保留时间的定量已经在特定的occupancy-driven小分子研究中起到重要的作用。

货号	名称	备注
BR100530	Series S Sensor Chip CM5, 3-pack	氨基偶联
29149603	Series S Sensor Chip CM5, 10-pack	氨基偶联
BR100050	Amine Coupling Kit	氨基偶联试剂盒
BR100531	Series S Sensor Chip SA, 3-pack	偶联生物素标记
28920234	Biotin CAPture Kit, Series S	偶联生物素标记