【罗工秘籍39】上机时如何去除粘连体

在常规多参数流式中，单细胞经过流式仪激光检测区所产生的荧光信号被PMT接收，形成电信号脉冲，如下图所示：

每个电信号脉冲都有面积（A）高度（H）宽度（W），所以我们在流式细胞仪上可以看到每个通道都有FSC-A/H/W和SSC-A/H/W

但是我们流式细胞仪采集或细胞分选单细胞数据时，可能会存在双细胞或多细胞复合物“污染”，这样的“污染”也就是我们俗称的粘连体，其通过激光检测口时，检测装置仍然认为它是一个信号。所以如果没有在分析时设门排除掉粘连体，那么就可能对结果造成误读。

那我们怎么排除粘黏细胞呢？

双粘连体的脉冲基本上是两个单粒子脉冲的合并，通常脉冲高度相等，但是双粘连体的脉冲面积和宽度将大于单个粒子脉冲的面积和宽度，所以我们可以利用单个粒子和双粘连体信号的脉冲参数之间的差异来将两者彼此区分开。
根据这个变化，一般考虑以下两种方法来排除粘连体

1、A和W
由于双粘连体的脉冲宽度大于单个粒子脉冲的宽度，基本达到两倍的关系，所以我们也会使用FSC-A与FSC-w来去除黏连细胞
 
并且细胞周期实验时，用A和W去黏连会更彻底，一般推荐使用FL2-A和FL2-W。

2、A和H
如前所述，正常二倍体和4倍体通过激光检测口时，H和A是成正比增大的，两者之间应该是呈45度角分布；而粘连体通过时，H不变，A增大，因此可通过FSC-A，FSC-H排除双粘连体。

但在实际结果中，A和H很少呈现45度角分布，总是小于45度，这是为什么呢？
一般说来，流式仪的激光束大多只有8um大小，而细胞很多都是大于8um的，他们通过激光束的时候就像下图所示：

那这样在通过激光束，收集的电信号脉冲是什么样的呢？

如上图，这种电信号脉冲就无法反映真正的细胞大小，但A不一样，因为细胞是整个通过的，所以A永远能反映细胞完整大小，所以就出现了FSC-A>FSC-H的现象。
针对这种情况，我们可以通过在BD的仪器上（Diva软件）调节FSC-A缩放因子（FSC Area Scaling）改变。将该因子调小，就可以使两者接近1：1，在两者散点图上基本位于45度角上。

以上方法，任选其一，你就可完美排除掉粘连体，避免粘连造成的非特异性染色或假阳性影响。
时间短暂，本周的罗工秘籍到这里也就告一段落了。更多流式小妙招持续更新中，记得持续关注哟！