多色文献案例Panel Design

文章主题:  Met-Flow, a strategy for single-cell metabolic analysis highlights dynamic changes in immune subpopulations
摘要：
合成代谢和分解代谢之间的复杂作用是白细胞发生免疫反应的能量基础,而且白细胞通过代谢状态的调节来适应环境的变化对于其发挥效应功能是至关重要的。然而，目前缺乏一种有效的方法在单细胞水平上去检测多个细胞亚群的代谢途径网络。Met-Flow 是一种 基于流式的检测方法,通过靶向多种代谢途径的关键蛋白和限速酶来捕获免疫细胞的代谢状态。由于免疫细胞的代谢状态与细胞的表型及功能息息相关,因而, Met-Flow有助于深入认识代谢状态的异质性在免疫反应中发挥的作用。本篇文献全文使用了FACSymphony多参数流式细胞仪和BD定制化的抗体,本次实验设计了27色的实验方案,实验产生的数据用BD FlowJo软件进行数据降维处理。

指标	荧光素	指标	荧光素	指标	荧光素
SLC20A1	AF647	CD4	BV480	CD14	PE-Cy7
ACAC	BUV496	CD8	BUV805	CD56	PE
HK1	BUV661	CD3	BB630	ILT3	BV605
CPT1A	BD V450	HLA-DR	BV786	CD69	APC-H7
IDH2	BB790	CD11c	BB700	CD86	BUV737
G6PD	BUV395	CD123	BV650	FVS575V（L/D）	BV570
GLUT1	AF488	IgM	BUV805	CCR7	BV650
ASS1	AF700	IgD	BV480	CD45RA	PE
PRDX2	BUV615	CD19	BB660	CD25	PE-Cy7
ATP5A	AF594	CD16	BV750	FOXP3	PE-Cyanine5.5
CD14	BV570

文章主题:   Immune Cell Landscape of Human Peripheral Blood by 25 Colors Flow Cytometry
摘要：
人外周血是最容易获取的人体样本，在医学类科研工作中至关重要。如何最大化、最高效地观察和利用有限的人外周血标本，通过一次实验检测得到更多的结果指标，对现有的实验研究意义重大。因此本文主要描述如何进行25色流式检测及介绍相关分析方法，通过对单个细胞同时检测25个参数，可以实现对外周血各种免疫细胞亚群的全景式描述，以及对某种细胞亚群的深度表型分析。

指标	荧光素	指标	荧光素
CD32	BUV395	CD45RA	BB515
CD16	BUV496	TCRgd	BB630
CD19	BUV563	CD195	BB660
lgD	BUV615	CD8	Percp-cy5.5
CD4	BUV661	CD38	CBB790
CD64	BUV737	CD11C	PE
CD14	BUV805	CD13	PE-CF594
CD57	BV421	CD123	PE-Cy5
CD3	BV480	CD25	PE-Cy7
CD15	BV650	CD127	AF647
CD27	BV711	CD560	APC-R700
CD20	BV750	HLA-DR7	APC-H7
CD197	BV786

人外周血免疫细胞群的 t-SNE 分析. 取 7 万个免疫细胞进行 t-SNE 分析，分析参数为补偿后的 25 个 maker。
A. 流式圈门后的不同细胞群显示 t-SNE 界面并合并在一起得到细胞群降维后的分布形态。
B. 在 t-SNE 分布图上根据每个细胞CD45RA 的表达情况 (即平均荧光强度) 做的热图，红色代表CD45RA 表达高，蓝色代表表达低。

文章主题:   A 31-Parameter Flow Cytometry Panel for In-depth Immunophenotyping of Human T  Cell Subsets Using Surface Markers
摘要：
剖析T细胞的功能多样性对于各种疾病机制的阐明以及疗法的发展至关重要。本文设计了一个31参数（29色）的方案，利用表面染色的技术，实现对人外周血和淋巴结的T细胞亚群和表型的的特征描述。
除适应性T细胞的标志物外，还包括TCRVα24-Jα18，TCRγδ，TCRVɑ7.2和CD161，以分别鉴定iNKT，γδT和MAIT细胞，它们是先天性T细胞。还包括CXC趋化因子受体（CXCR3，CXCR4，CXCR5，CXCR6）和CC基序趋化因子受体（CCR4，CCR6，CCR7）以鉴定Th细胞亚群（Th1，Th2，Th17），Tfh细胞亚群（Tfh1，Tfh2，Tfh17）和具有特定归巢能力的Th细胞。
在该方案中还使用了标志物来评估细胞分化（CD45RO，CD7），活化（CD57，CD95，HLA-DR）和某些共信号分子（PD-1，NKG2D，CD28）的表达。特别地，CD69和CD103也包括在内，用于组织驻留记忆T（Trm）细胞的进一步分析。该方案能够对人类T细胞亚群进行深入的免疫表型分析，并可应用于各种免疫相关疾病的监测，预后和机制研究。

指标	荧光素	指标	荧光素	指标	荧光素	指标	荧光素
Live/Dead	Zombie	CD127	PE-Cy5	CXCR6	BB700	CD45RO	PE-CF594
CD45	APC-R700	TCRV7.2	BV570	CCR4	BUV395	CD161	BUV737
CD3	BUV805	TCRv S	APC	CCR6	BUV496	CD28	PE
CD4	BV750	TCRVa24-Jai8	BV711	CCR7	APC-Cy7	CD95	BUV661
CD8	BV786	CXCR3	BV510	NKG2D	BB660	CD57	BV480
CD56	BV650	CXCR4	Buvses	CD69	BB790	CD7	PE-Cy7
CD25	BV421	CXCR5	BUV615	CD103	BB630	PD-1	BB515
HLA-DR	BV605

文章主题:   OMIP-060–30-Parameter Flow Cytometry Panel to Assess T Cell Effector Functions and Regulatory T Cells
摘要：
全面解析αβ T和γδ T细胞各亚群的发育、活化、效应功能以及调节性T细胞的特征，不仅可以借鉴其30参数的流式方案，还可以拓展T细胞功能研究的新思路。另外，该方案经过PMA+离子霉素刺激以及细胞固定破膜处理，对于检测胞内细胞因子多色流式方案的小伙伴们也有很好的参考价值！
该文献基于BD FACSymphony™搭配了一个30个参数28个荧光的流式方案，该方案可利用于疫苗研究，以及深度分析T细胞在对抗病原体或免疫病理学中的效应功能。

指标	荧光素	指标	荧光素	指标	荧光素
CD3	APC-H7	CD28	PE	CD 107a	Ax700
CD4	BUV496	CD39	0UV661	Granryme B	FfTC
CDS	BUV805	CD45RO	BV570	Pertonn	Ax594
TCR相	PE	CD95	BUV737	IL-?	0V421
CD26	SUV683	Ki-67	BV650	IL-B	BB630
FoxP3	PECy5 5	CD69	BV711	IL-13	BB660
CCR7	BUV39&	com	SB790	IL17A	BV605
CD27	BV786	CD154	0V48O	IL-21	Ax647
IL-22	PE-Cy7	IFNy	BB700	W	BV750
Viability	live Dead UV Blue

文章主题:   OMIP-056: Evaluation of Human Conventional T Cells, Donor-Unrestricted T Cells, and NK Cells Including Memory Phenotype by Intracellular Cytokine Staining
摘要：
本篇OMIP通过胞内细胞因子染色（ICS）技术，借助多色流式细胞术，分析人类免疫系统中常规T细胞、γδT、MAIT、NKT、NK细胞等对各种抗原的反应，并对其功能和记忆能力进行鉴定，有助于评估不同人对候选疫苗的反应。

文章主题:  The Complement System Is Essential for the Phagocytosis of Mesenchymal Stromal Cells by Monocytes
摘要：
间充质基质细胞（MSC)治疗是治疗慢性炎症疾病的有前途的工具。这归因于 MSC 释放多种免疫调节因子的能力。然而，在不同疾病中治疗性 MSC 作用模式的所有方面仍未解决，这主要是因为大多数输注的 MSC 在输注后数小时内在循环中无法检测到。这项研究的目的是阐明与血浆接触后 MSC 的命运。我们发现与血液接触后，包括 C3b/iC3b 在内的补体蛋白会沉积在 MSC 上。重要的是，我们还发现与 MSC 结合的补体通过涉及 C3 但不涉及 C5 的机制增强了经典和中间单核细胞的吞噬作用。因此，我们首次描述了一种机制，该机制可能至少部分地解释了 为什么输液后血液循环中未发现 MSC。我们的结果表明，MSC 的免疫调节作用可以由吞噬它们的单核细胞介导。

文章主题:   Forty-Color Full Spectrum Flow Cytometry Panel for Deep Immunophenotyping of Major  Cell Subsets in Human Peripheral Blood

摘要：
这种基于40色流式细胞仪的Panel被开发用于对人类外周血中主要细胞亚群的深入免疫表型。样本的可用性往往会很有限，特别是在临床试验材料的情况下，当需要从单个样本或时间点进行多种类型的测试时。最大限度地提高可以从单个样本中获得的信息量，不仅可以提供更深入的免疫系统特征，而且有助于解决样本可用性有限的问题。
这里展示的Panel鉴定了CD4T细胞、CD8T细胞、调节性T细胞、γδT细胞、NKT样细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞和树突状细胞。对于每种特定的细胞类型，该Panel包括通过选择激活和分化标记物以及趋化因子受体，以及趋化因子受体。此外，在一个管中多个标记的组合可能导致新的免疫表型的发现及其在某些疾病中的相关性。值得注意的是，该Panel设计只包括表面标记物，以避免需要固定和破膜的步骤步骤。

对来自四个供体的PBMCs进行高维数据分析，显示FlowSOM簇投射到两个UMAP维度上，以显示手动和自动分析技术之间的一致性。覆盖图显示了来自所有四个样本的连接事件，而密度图显示了单个样本之间的种群分布的差异。
文章主题:   Robust T cell immunity in convalescent individuals with  asymptomatic or mild COVID-19
摘要：
Cell期刊于8月14日发表了瑞典卡罗林斯卡学院和英国威尔士大学医院等机构的文章“Robust T cell immunity in convalescent individuals with asymptomatic or mild COVID-19”。文章指出，SARS-CoV-2特异性记忆T细胞将可能被证明对抵抗COVID-19的长期免疫保护至关重要。该文章系统地绘制了未暴露个体、暴露的家庭成员以及患有急性COVID-19或恢复期的个体中SARS-CoV-2特异性T细胞反应的功能和表型图谱。急性期SARS-CoV-2特异性T细胞表现出与疾病严重程度的各种临床标志物相关的高度活化的细胞毒性表型，而恢复期SARS-CoV-2特异性T细胞具有多种功能，并表现出干性记忆表型。重要的是，可在抗体血清反应阴性的家族成员以及有无症状和轻度COVID-19病史的恢复期个体中检测到SARS-CoV-2特异性T细胞。文章表示，该综合数据集显示，SARS-CoV-2引发强烈、广泛且功能强大的记忆T细胞反应，表明自然暴露或感染可预防严重COVID-19的复发。

对来自四个供体的PBMCs进行高维数据分析，显示FlowSOM簇投射到两个UMAP维度上，以显示手动和自动分析技术之间的一致性。覆盖图显示了来自所有四个样本的连接事件，而密度图显示了单个样本之间的种群分布的差异。

文章主题:   TIM-3 Regulates CD103+ Dendritic Cell Function and Response to Chemotherapy in Breast Cancer
摘要：
现有的许多免疫治疗药物的靶标都是T细胞。一旦激活后，T细胞可以回到肿瘤中并靶向摧毁肿瘤。尽管这些药物已经取得了不少成功，但是一些病人对这些药物并无反应。墨菲特的研究人员想确定通过靶向另一种叫做树突状细胞（DC）的免疫细胞是否可以激活T细胞的抗癌活性。
研究人员在乳腺癌组织样品和小鼠乳腺癌模型中进行了一系列实验。他们发现乳腺癌组织中的DC表达蛋白TIM-3。TIM-3在调节免疫系统中发挥重要作用，因此靶向DC的TIM-3有可能激活T细胞。他们使用靶向TIM-3的抗体药物与紫杉醇联合使用可以更好地减小小鼠乳腺癌肿瘤，这表明这个想法是可行的。
接下来研究人员想知道TIM-3抗体是如何激活免疫系统的。他们发现TIM-3抗体治疗可以使DC产生化学信号分子激活T细胞，因此产生了抗癌免疫反应。

文章主题:   NK Cells Stimulate Recruitment of cDC1 into the Tumor Microenvironment Promoting 
摘要：
肿瘤内有着各种各样的免疫细胞，比如T细胞、B细胞和自然杀伤（NK）细胞，它们影响癌症发展以及肿瘤对免疫疗法的响应。近日，英国Francis Crick研究所的科学家在Cell杂志上发表研究，表明小鼠在将常规的树突状细胞（Conventional type 1 dendritic cells，cDC1）招募至肿瘤时，NK细胞发挥关键作用。
这篇题为“NK Cells Stimulate Recruitment of cDC1 into the Tumor Microenvironment Promoting Cancer Immune Control”的文章表明，cDC1在对抗肿瘤的免疫力上至关重要，而癌症患者的存活期与NK和cDC1细胞的丰度有关。
实验表明，NK细胞产生了两种关键的趋化因子：CCL5和XCL1，它们向cDC1发出信号，通知它们向肿瘤迁移，并在肿瘤内积累。在肿瘤内部，cDC1攻击T细胞，这可能导致癌症患者对T细胞疗法的反应增加。
这篇文章的通讯作者之一、Francis Crick研究所的Caetano Reis e Sousa教授表示：“这项结果让我们重新认识到NK细胞和cDC1细胞在抗癌免疫反应中的重要性。现在的研究还处于早期阶段，但将更多的cDC1招募至肿瘤，也许会为新的免疫疗法奠定基础。”cDC1 Accumulate in the TME of PGE2-Deficient Tumors
众所周知，某些肿瘤产生前列腺素E2（PGE2），协助避免抗癌免疫反应的产生。研究结果表明，NK细胞是PGE2的主要靶点，可以防止免疫细胞在肿瘤中积累。NK细胞的缺乏导致CCL5和XCL1的产量减少，导致cDC1招募和免疫应答的明显下降。

文章主题:   Opposing Functions of Interferon Coordinate Adaptive and Innate Immune Responses to Cancer Immune Checkpoint  Blockade
摘要：
免疫检查点阻断治疗（Immune checkpoint blockade, ICB）对多种肿瘤都有持续较好的疗效，但某些肿瘤对ICB治疗会产生抗性并复发。免疫细胞和肿瘤细胞的一些内在因素皆可影响患者对ICB反应。免疫因素包括T细胞浸润的情况，T细胞以及固有免疫细胞分化激活的状态。肿瘤细胞中能影响ICB反应的因素包括肿瘤新抗原的组成，抗原提呈到MHC-I分子上的能力，抑制性受体配体的表达等。探究这些因素作用的具体机制，以便对其进行调控，增加肿瘤免疫治疗的效果。
IFNs在起始阶段能激活树突状细胞促进肿瘤特异性CD8+T细胞的交叉激活，但是持续性的IFNs可产生负反馈效应，引起T细胞的耗竭而产生免疫抑制的作用。通过调控IFNs正向或负向免疫反应，或可增强机体对肿瘤的免疫反应。
该文章研究表明抑制肿瘤细胞中IFNG（Interferon γ ）信号通路，可以增强机体对肿瘤细胞的适应性或固有免疫杀伤能力，提高肿瘤免疫治疗的效果。

文章主题:   Tissue microenvironment dictates the fate and tumorsuppressive function of type 3 ILCs 
摘要：
先天淋巴样细胞 (ILCs) 根据其转录因子和细胞因子被分为“功能亚群”。尽管 IL-12 和 IL-23 等细胞因子已被证明可提高 ILCs 的可塑性，但对其形成机制并不清楚。而组织微环境可以影响这些细胞的可塑性、表型和功能。作者清楚地展示了淋巴和非淋巴器官的 rorc 依赖性 ILCs 组织的界限。虽然肠道Rorcfm+ILCs 能够展示出的 ILC3/ 淋巴组织来源的 Rorcfm+ILCs/ 获得自然杀伤 (NK) 细胞 ILC1 样的表型。通过将 Rorcfm+ILCs 过继转移到受体小鼠体内，作者发现 ILCs 分布在多种受体小鼠中器官中，其表型适应其所入侵的组织环境。在研究它们的功能特性时，作者发现只有淋巴组织内的 Rorcfm+ILCs 能抑制肿瘤生长，而肠道内的 Rorcfm-ILC1s 或 NK 能抑制肿瘤生长却不能抑制肿瘤的进展。因此，作者认为组织微环境与个体发生相结合，其表型不足以预测 ILCs 的功能特性。

文章主题:   Blockade of the Phagocytic Receptor MerTK on Tumor-Associated Macrophages Enhances P2X7R-Dependent STING Activation by Tumor-Derived cGAMP
摘要：
巨噬细胞清除凋亡细胞可防止过度炎症并支持免疫耐受。在本篇文章中，研究了阻断凋亡细胞清除对抗肿瘤免疫反应的影响。作者生成了一种通过吞噬受体MerTK选择性抑制吞噬作用的抗体。阻断MerTK导致肿瘤内凋亡细胞的积累，并触发I型干扰素反应。用抗mertk抗体治疗荷瘤小鼠可刺激T细胞激活，并与抗pd-1或抗PD-L1治疗有协同作用。抗mertk治疗诱导的抗肿瘤作用在Stinggt/gt小鼠中丢失，而在Cgas/小鼠中没有。在Cgas/肿瘤细胞中取消cGAMP的产生，细胞外ATP的消耗，或ATP门控的P2X7R通道的失活也损害了MerTK阻断的作用。在机制上，细胞外ATP通过P2X7R增强细胞外cGAMP向巨噬细胞的运输和随后的刺激活。因此，MerTK阻断增加了肿瘤免疫原性，增强抗肿瘤免疫，这对癌症免疫治疗具有重要意义。

 

文章主题:   High-dimensional single cell analysis identifies stem like cytotoxic CD8+ T cells infiltrating  human tumors
摘要：
浸润肿瘤中的CD8+T细胞多存在功能异常情况，但其亚群是否能保持较好的功能?为了对此进行研究,作者通过对53例肺癌患者的百万级CD8+T细胞进行单细胞分析,探讨了肺癌患者CD8+T细胞的表达机制,定义了与无癌组织和血液相比，在肿瘤中富集的亚群。排除掉被激活的细胞后，作者发现CXCR5+TIM3-CD8+T细胞出现了部分衰竭的表型。同时,通过全转录组的单细胞测序方法，发现该种亚群的基因网络导致了该亚群的干细胞样可塑性和细胞毒性。另一方面,该细胞亚群表现出更强的自我更新和多能性。抑制和共刺激受体分析实验显示，PD-1、TIGIT和CD27可能成为免疫治疗的靶点。因此,作者证明了在人类与小鼠的癌症模型中，T细胞衰竭存在层级性的差异，且随着疾病的发展而逐步消失。
作者利用BD FACSymphonyTM分析了肿瘤/血液/正常(癌旁)组织中丰富的免疫细胞亚群,单次实验中颜色多达25色。并用BD FlowJoTM软件进行了分析,二者结合产生了文章的主要数据,为结论提供了有力的实验证据。

文章主题:   High-Dimensional Single-Cell Mapping of Central Nervous System Immune Cells Reveals Distinct Myeloid Subsets  in  Health, Aging, and Disease
摘要：
有报告称，中枢神经系统(CNS)包含多种类型的免疫细胞,具有维持稳态、免疫防御以及预防神经系统疾病的功能。描绘整个大脑中的白细胞图谱是一件极具挑战的事情,尤其在病理学中，复杂的表型变化和血液的不断冲刷使得区分白细胞变得困难。研究人员应用了高维度单细胞测序和免疫荧光流式以及基因定位系统,识别，定位,描述多个在哺乳动物的中枢神经系统中不同的免疫细胞变化。用这种方法，作者发现了小神经胶质，巨噬细胞亚群和树突状细胞在中枢神经系统中稳定共存。在阿尔兹海默症和多发性硬化症等老化的疾病模型中，中枢免疫系统微环境表现出疾病特异性的转变。以上发现为疾病机制的研究提供了宝贵资源，可以在中枢神经系统疾病作为潜在的生物标志物和治疗靶点。
全文利用BD FACSymphony做了大量的流式实验，也用了大量BD抗体，单次实验中颜色多达22色,并应用BD FlowJoTM软件进行了数据分析。

文章主题:   A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue  environment
摘要：
大脑中含有多种免疫细胞，它们对大脑功能起着重要作用。VUB的VIB炎症研究中心的Kiavash Movahedi教授领导的一个研究小组已经开发了一个完整的大脑免疫细胞图谱。这不仅揭示了巨噬细胞惊人的多样性，也揭示了小胶质细胞的存在。值得注意的是，这些以前不为人知的小胶质细胞与通常与阿尔茨海默氏症等神经退行性疾病相关的小胶质细胞有明显的相似之处。这些新发现对于了解巨噬细胞在健康大脑生理学中的作用以及开发未来神经退行性疾病的治疗方法都非常重要。