小鼠肿瘤组织样本中-分离肿瘤细胞

在此protocol中，我们描述了如何在一个简单的实验流程中分离未接触的小鼠肿瘤细胞，从而提高下游应用的灵敏度以及减少下游应用的偏差（包括二代测序和肿瘤细胞培养）。 将小鼠实体肿瘤组织制备成单细胞悬液，然后使用MACS®技术分离未接触的肿瘤细胞。

所需试剂和耗材

1.    肿瘤组织解离
用Gentle MACS™全自动加热组织处理器以及小鼠肿瘤解离试剂盒制备单细胞悬液。
参考Tumor Dissociation Kit, mouse 使用说明。

2.    肿瘤细胞的分离
使用肿瘤细胞分离试剂盒，小鼠和LS分选柱分离未接触的小鼠肿瘤细胞。
▲建议磁性标记后的的细胞悬液过滤，以确保上分选柱之前是单个细胞。
（1）在LS分选柱上放置一个分离前过滤器（70 µm）。
（2）用PBS冲洗分选柱3次，确保过滤器已预先润湿。
（3）将细胞悬液和PB缓冲液加到柱上的过滤器上。
 

去除分选肿瘤细胞的一般工作流程。
该程序基于用自动组织解离以及磁珠标记分离出非肿瘤来源细胞。阴选策略无需特定的细胞表面指标的表达即可分离出肿瘤细胞。即使从含有少量肿瘤细胞的样品中，可在不到20分钟的时间内实现较高的分离纯度（> 95％）。
 
流式细胞术分析分离的三种不同的同源小鼠肿瘤细胞。
小鼠肿瘤细胞分离试剂盒的抗体混合物耗尽了多余的非肿瘤细胞，因此细胞分离与肿瘤细胞特异性表面标志物无关。如上图所示，从表达GFP的细胞系诱导的不同小鼠肿瘤中分离肿瘤细胞，可以不考虑肿瘤实体而分离肿瘤细胞。
 
7天后，分离出的肿瘤细胞培养物几乎是纯净的。 
磁性分离后，将原始体积（左）和分离后的肿瘤细胞（右）分别培养3至7天，固定，染色。通过肿瘤细胞特异的GFP表达检测同系小鼠肿瘤细胞，并用α-平滑肌肌动蛋白对成纤维细胞进行染色。