外泌体纯化——小优给您来支招

部分内容引自Cytiva思拓凡
外泌体（Exosome）是发现于1986年，一种直径约30~150nm的双层膜囊泡状结构小体，可由机体内多种细胞如免疫细胞、干细胞、心血管细胞、网织红细胞、血小板、神经细胞和肿瘤细胞等主动分泌产生，广泛分布于外周血、尿液、唾液、乳汁、腹水、羊水等体液中。

 
图1：外泌体的电子显微图片（左）与中等大小外泌体的图解（右）

外泌体携带大量特异性的蛋白质（如细胞因子、生长因子）以及功能性的mRNAs、miRNAs等生物活性物质，在体内参与细胞通讯、细胞迁移、促血管新生和抗肿瘤免疫等生理过程，与多种疾病的发生和进程密切相关。由于外泌体的特殊结构和功能，使得它具有潜在的应用价值，一方面可以作为诊断多种疾病的生物指标，另一方面也可以作为治疗手段，未来有可能作为药物的天然载体用于临床治疗。
外泌体的研究日益活跃并令人瞩目。但是，由于外泌体的纳米尺寸，同其它类型的胞外囊泡在理化和生化特征上部分重叠，以及自身在大小、组成和功能方面存在异质性，其分离纯化也面临挑战。下面我们给大家从文献中总结出了目前几大主流外泌体纯化方法，供大家参考。

1、差速离心法（UC）
通过差速超速离心分离外来体通常包括一系列不同离心力和持续时间的离心循环，以根据外来体与样品中其他成分的密度和大小差异来分离外来体，是目前最常用的分析方法。

 
图2：差速超速离心分离外泌体的示意图

优势：降低了使用分离试剂造成的污染和成本；样本处理量大，产量高。
缺点：仪器成本投入高，笨重，运行时间长，耗人力，不便携；超速离心可能破坏外泌体而影响下游分析；经常存在杂蛋白和脂蛋白污染。

2、基于大小的分离技术
超滤离心法也是目前很常用的纯化方法之一，其采用不同膜大小和截留分子量（MWCO）的膜过滤器，使大于MWCO的颗粒留下，而小于MWCO的颗粒被丢弃，超滤法作为一种有效的浓缩方法经常与其他外泌体分离方法联合应用。

 
图3：顺序过滤示意图。首先，去除细胞和细胞碎片。其次，滤出游离蛋白，浓缩样品。最后，去除大于100纳米的细胞外小泡。

分子排阻层析(SEC)也常被报道用于外泌体制备，使用具有化学惰性和稳定性的多孔填料，采用非吸附的层析方法，按照不同大小分子流经的路径长短不同来进行样品分离。外泌体在填料的排阻极限之外，无法进入填料的孔隙中，而紧跟着外水体积最先排出；蛋白等其它杂质由于分子量小，可以进入填料孔隙中，经过较长的路径而晚出峰，由此分离。
优势：超滤：快速，不需要特殊仪器，便携。将RNA提取液流经膜可直接用于RNA抽提。SEC：较高纯度外泌体；通常在重力流下操作从而保留了外泌体的完整性和生物活性；可重复性好；中度样本处理量。

缺点：超滤：仪器成本低，中等纯度；剪切力可引起外泌体损伤；有可能造成聚集和囊泡陷入膜孔中，或外泌体吸附在膜上而损失。SEC：仪器成本中等，需要专用的设备；不易放大，运行时间长。

3、外泌体沉淀（PEG-base）
聚乙二醇(PEG)，它在水中具有超溶性，可以“束缚”水分子，迫使较难溶的成分，如EV、外泌体、蛋白质和其它较难溶的成分从溶液中分离出来。通常是4℃用PEG孵育样品过夜，随后通过低速离心或过滤即可沉淀回收外泌体。
优势：容易操作，不需要特殊仪器；样本处理量大，具有可放大性。
缺点：缺乏选择性的分离机制，容易和非外泌体污染共沉淀，如其它胞外囊泡、蛋白聚集体、 高丰度蛋白等；运行时间长，需要在分离前先去除脂蛋白等亚细胞颗粒，在分离后去除聚合物材料。

4、免疫亲和捕获技术
免疫捕获过程需要使用微珠，通常约1μm，其带有铁核，通常被称为磁珠，这些磁珠表面包被有可识别外泌体表面标记物(如CD9、CD63和CD81)的捕获分子。捕获分子通常是抗体，但也可能是配体或纳米小体。磁珠可生产用于捕获一个表面标记，如CD63，或使用泛捕获方法捕获所有这三个表面标记。
优势：针对特定来源或亚群的外泌体分离是很好的选择；相比于其它分离方法，纯度要高出很多；利于外泌体的分型。
缺点：试剂成本高，需要预先确认好的外泌体标签(抗原)；样本处理量低，只有带标签的外泌体被识别而产量低；仅适用于Cell-free样品；肿瘤的异质性妨碍了免疫识别，可能会造成假阴性；抗原表位可能被封闭或掩藏。

5、微流控技术
微尺度下，利用外泌体的生理和生化特性进行分离，如免疫亲和特性、大小和密度，结合新兴的声波纳滤、电磁和电泳等技术。微流控技术包括捕获微流控技术、过滤微流控技术、磁分离微流控技术、声学分离微流控技术和介电泳微流控技术等。
优势：快速、低成本、高度便携、容易实现自动化，可将外泌体分离和后续检测进行集成。
缺点：缺乏标准化和大规模的临床样本测试，缺少方法验证，低/中等程度的样本处理量。.

相关产品介绍

凝胶过滤层析

Cytiva SEC填料具有多种选择性，可分离分子质量范围达100 (Mr)至100,000,000 (Mr)Da，可分离的物质涵盖小分子的多肽到大蛋白、蛋白复合物和病毒。
 
图4：经典高分辨率凝胶过滤图谱

Cytiva提供全新一代Increase系列分子筛预装柱，专门为小规模制备纯化及分析而设计。
 
Cytiva针对不同的实验目的，提供了3种不同规格的预装柱：
 

规格(mm×mm)	Superdex 30 Increase	Superdex 75 Increase	Superdex 200 Increase	Superose 6 Increase
10×300	29219757	29148721	28990944	29091596
5×150	客户定制	29148722	28990945	29091597
3.2×300	29219758	29148723	28990946	29091598

多模式填料Capto Core 400与Capto Core 700
Capto Core 400与Capto Core 700填料设计用于病毒和其他生物大分子的纯化。填料外壳5μm钝化层可以排阻分子量大于400KDa或700KDa以上的大分子，而小于此排阻极限的分子则进入孔内结合辛胺配基。在病毒纯化过程中则病毒流穿，杂质吸附到孔内辛胺基上，同时表现出大小分离以及吸附层析的双重功能。

 
图5：Capto Core系列多模式填料结构示意图

基于上述特点，Capto Core 700 和普通的分子排阻层析相比：
1. 流穿模式，上样量更高，根据不同样品可以多达 5-20 倍柱体积（Column Volume，CV），相比于分子排阻层析的不足 0.1 CV，高出了约 100 倍。在使用和放大过程中，降低了耗材和硬件投入；
2.基于 Capto 的新一代高流速琼脂糖基架，流速压力曲线好，节省操作时间。
3. 性能稳定，便于直接优化和工艺放大。另外，Capto Core 700 为 Bioprocess 级别填料，生产环境、法规支持文件和安全供货均有保障
 

产品代码	产品	包装
17372411	HiTrap Capto Core 400	5×1mL
17372410	HiScreen Capto Core 400	1×4.7mL
17548151	HiTrap Capto Core 700	5×1mL
17548115	HiScreen Capto Core 700	1×4.7mL
17372401	Core 400	25mL
17372402		100mL
17372403		1L
17372404		5L
17372460		60L
17548101	Core 700	25mL
17548102		100mL
17548103		1L
17548104		5L
17548160		60L

接下来，我们将以一个典型案例，看一下 Capto Core 700 在外泌体纯化领域的应用：
 
2017 年，Corso G等发表文章，尝试将 Capto Core 700 的应用从病毒纯化延伸到细胞上清中的外泌体纯化，并和超速离心进行了比较。在进行大规模纯化（50~200 mL）的探究中，为了避免杂质超载，作者使用切向流过滤（Tangential Flow Filtration，TFF）对样品进行了透析和浓缩。
样品来源为小鼠神经母细胞瘤 N2a 细胞和小鼠成肌细胞 C2C12 的条件培养基（Conditioned Medium, CM）。工艺路线如下：
 
 
相比超速离心的方式，该工艺很好的保留了外泌体完整性和粒径大小；回收率约 80%；样品纯度、EV Markers 和靶细胞对外泌体的摄取，均可匹敌超速离心方式；节省时间（小体积 85 min；大规模 150 min）；重复性好；可放大。
2019 年，作者团队又将该应用拓展到了干细胞领域。样品为永生化的、人骨髓来源的间充质干细胞（hTert+ MSCs）的条件培养基，经过 TFF/Capto Core 700 纯化后，100 mL 样品中约获得了 5 × 10^10 个 EVs。
部分相关产品

货号	名称	特点
28990944	Superdex 200 increase 10/300 GL	高分辨率首选
29091596	Superose 6 increase 10/300 GL	分离范围广
28935605	Hiprep 26/60 sephacryl S-400 HR	经济高效，选择最多
17508702	Hiprep 26/10 desalting	脱盐、缓冲液置换
17372411	Hitrap Capto Core 400	用于病毒和其他生物大分子的中度及精细纯化，截留分子量400KDa
17548101	Capto Core 700	为病毒和其他生物大分子的精细纯化设计的填料，截留分子量700KDa

超滤管相关产品
 

截留分子量（MWCO）	处理样品体积
	100-500μl	400μl-2mL	2-6mL	5-20mL
3K	28932218	28932240	28932293	28932358
5K	28932223	28932245	28932294	28932359
10K	28932225	28932247	28932296	28932360
30K	28932235	28932248	28932317	28932361
50K	28932236	28932257	28932318	28932362
100K	28932237	28932258	28932319	28932363

参考文献：
Bellingham SA, Guo BB, Coleman BM, Hill AF. Exosomes: vehicles for the transfer of toxic proteins associated with neurodegenerative diseases? Front Physiol. 2012 May 3;3:124.
Li P, Kaslan M, Lee SH, Yao J, Gao Z. Progress in Exosome Isolation Techniques. Theranostics. 2017 Jan 26;7(3):789-804.
Corso G, et al. Reproducible and scalable purification of extracellular vesicles using combined bind-elute and size exclusion chromatography. Sci Rep. 2017 Sep 14;7(1):11561.