【罗工流式宝典第5式】从人和小鼠的皮肤组织制备单细胞悬液

皮肤作为身体与环境之间的隔绝屏障，是抵御外部物理、化学和生物侵害的第一道防线。皮肤由两个主要部分组成，即表皮和真皮，并包含多种免疫细胞，包括朗格汉斯细胞、巨噬细胞、树突细胞和约 200 亿个记忆T细胞，几乎是整个血容量的两倍。越来越多的数据支持这样一种观点，即皮肤在组织稳态和各种病理条件下都具有基本的免疫功能。
驻留在皮肤中的免疫细胞具有免疫监视作用，并且已被证明在炎症性疾病（如牛皮癣，银屑病）的发展中发挥作用。然而，这些细胞群很难研究，因为现有技术分离的细胞数少，且活性差，这使得这些细胞群的检测及离体细胞培养都变得极为困难。
本文整理了皮肤组织解离的方法
 

图1：皮肤构造和效应细胞

实验前准备

耗材	试剂
穿孔仪、手术刀、剪子、镊子、培养皿、6孔板、组织解离管、50ml离心管、细胞过滤器、钳子	培基、双抗、血清、胶原酶 I-A、DNase I、Collagenase II 、透明质酸酶

从人体皮肤制备单细胞悬液

一、方法一：
注：如果需要后续细胞培养，请在超净工作台中无菌操作
1. 制备细胞培养基：RPMI 1640 + 青霉素/链霉素（终浓度分别为 100 U/ml 和 100 µg/ml）+ 丙酮酸 (0.02 mM) 和 谷氨酰胺 (0.02 mM)，不添加血清。
2、制备完全培养基：步骤1制备的细胞培养基+10%人混合血清（HPS）； 4°C 保存，使用前将培养基调至 20± 2°C。
3. 使用 4 mm圆形活检穿孔仪获取皮肤活检组织，并将其保存在完全培养基中，在20± 2°C下最多 4 h，到达实验室后尽快进行后续操作。（注意：长期体外储存会显著影响细胞产量和细胞活力）
4. 在蓝色盖的Miltenyi组织解离管做好标记，加入5 ml完全培养备用。
5. 在6 孔培养板的每个孔（共3个孔）中加入2 ml完全培养基。活组织检查放入一个孔中，冲洗干净，将其移到第2个孔中，再重复此步骤1次，从而总共冲洗3次。
6. 将冲洗干净的皮肤活检组织转移到培养皿中，加入100 µl完全培养基，小心地刮掉皮下脂肪组织。
7. 将每个组织切成4个小块。将样品（每管最多4个4 mm的活组织）转移到含有步骤4的5 ml解离管中。
8. 盖紧管子，倒置连接到自动组织分离器的套管上。
9. 通过运行“程序 m_spleen _01”
10. 处理后，从解离器上拆下解离管，并确保所有解离材料都收集在管底部。
（注：7-10步使用的是Miltenyi的GentleMacs组织解离器，多种测试后用预定义脾脏解离的程序效果最佳，有相关仪器，可极大程度的提高细胞得率及活性，如无，则直接跳过这4步，改为小刀或剪刀将组织尽可能的剪碎后直接进行步骤11）
11. 在解离管中加入150 µl 胶原酶 I-A (80 mg/ml)，在37 °C的振荡水浴或摇床中孵育样品60 min。向解离管中加入 100 µl DNase I (5 MU/ml)，混匀。（注: 胶原酶浓度较高或孵育时间较长会改变细胞活力）
12. 将解离管连接到GentleMacs上并运行“程序 m_spleen_01”以再次研磨。
13. 将70 µM细胞过滤器放在 50 ml 离心管管的顶部。将分离的样品悬液用细胞过滤器以去除细胞团块和组织碎片。
14. 用5 ml完全培养基清洗细胞过滤器一次。在 20± 2°C 、450 x g下离心10 min并吸出上清液。
15. 再重复一次洗涤步骤。在300 µl完全培养基中重悬细胞沉淀。

 
图2：人皮肤组织的取样

二、方法二：
商品化酶消化法

适用样本类型	货号	品名	规格	品牌
表皮解离试剂盒	130-103-464	Epidermis Dissociation Kit, human	100 preparations	Miltenyi
全部皮肤解离试剂盒	130-101-540	Whole Skin Dissociation Kit, human	50 preparations	Miltenyi

产品说明书自带详细protocol，细胞得率高、活性好，实验温和、快速、可重复性高、产品无批次间差异。

从小鼠皮肤制备单细胞悬液

一、方法一：
注：如果需要后续细胞培养，请在超净工作台中无菌操作
1.    将手腕和踝关节正上方的四肢切断，然后完全切断尾巴，留下一个小孔。
2.    要剥下整个皮肤：首先将锋利的剪刀插入尾部的孔中，然后沿着身体的背中线将皮肤剪到脖子上的开口处。接下来，用一把钳子抓住暴露的身体，另一把钳子抓住皮肤，用一个连续的动作轻轻地把整个皮肤从身体上剥下来，
将皮肤作为一个完整的部分剥离，小心不要将皮肤分成碎片，避免细胞丢失。
要剥掉尾皮：首先切除尾尖形成一个开口，用锋利的刀片沿着尾皮从底部到尾尖切开。 接下来，用一把钳子抓住暴露的尾骨，另一把钳子抓住皮肤，用一个连续的动作轻轻地将尾皮从骨头上剥下来。 延中线去切，使每块皮肤的长度小于 2-3 cm。
3.    皮肤放置于冰上的培养皿中，并用完全培养基在培养皿中轻轻摇晃清洗3次。
4.    弃去清洗液后，在培养皿中加入500ul-1ml的酶消化液（RPMI-1640：3.5 mg/ml Collagenase II 、0.02 mg/mL DNase I、0.002 mg/mL透明质酸酶）、用剪刀将皮肤组织尽量剪碎。
5.    待组织剪碎后，用移液器将剪碎的组织转入15mL 离心管内，同时用酶消化液将残余在皿中的组织充分收集，每管 10mL 酶消化液。
6.    在37 °C的振荡水浴或摇床中孵育样品60 min。
7.    将70 µM细胞过滤器放在 50 ml 离心管管的顶部。将分离的样品悬液用细胞过滤器以去除细胞团块和组织碎片。
8.    用5 ml完全培养基清洗细胞过滤器一次。在 20± 2°C 、450 x g下离心10 min并吸出上清液。
9.    再重复一次洗涤步骤。在300 µl完全培养基中重悬细胞沉淀。
注：消化组织前后，有条件结合GentleMacs仪器进行研磨效果更佳

 
图3：小鼠皮肤组织的取样

二、方法二：
商品化酶消化法

适用样本类型	货号	品名	规格	品牌
表皮解离试剂盒	130-095-928	Epidermis Dissociation Kit, mouse	25 preparations	Miltenyi

参考文献：
[1] Nestle F O, Meglio P D, Qin J Z, et al. Skin immune sentinels in health and disease[J]. Nature Reviews Immunology, 2009, 9(10):679-91.
[2] He X, Oliveira V, Keijsers R, et al. Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture[J]. Journal of Visualized Experiments : JoVE, 2016, (110).
[3] F Li, Adase C A, Zhang L J. Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin[J]. Journal of Visualized Experiments : Jove, 2017, 2017(125).