利用HALO对三级淋巴结构进行全方位分析（一）

三级淋巴结构（Tertiary lymphoid structure，TLS）是存在于肿瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病、器官移植等疾病慢性炎症部位周围的异位淋巴组织，其结构和功能与次级淋巴器官相似，是肿瘤微环境中抗肿瘤免疫应答启动的直接部位，对患者生存预后、治疗反应及免疫治疗应答评估均有积极作用。

TLS因其直接的位置分布及强大的免疫功能，在肿瘤免疫治疗中被寄予厚望。在肿瘤中，TLS的形成象征免疫细胞的浸润及对肿瘤的杀伤作用的增强，是患者生存和预后的积极因素。TLS是组成肿瘤微环境的重要因素，是肿瘤免疫应答的直接启动部位，可以更好地诱导T细胞启动，防止T细胞衰竭或无能，其密度对肿瘤的预后有预测作用。在免疫低肿瘤和免疫高肿瘤中诱导TLS新生，与抑制炎性环境和/或免疫检查点抑制剂的治疗剂组合的策略，代表了癌症治疗的新希望。

当肿瘤发生时，TLS通常在肿瘤浸润部位产生。TLS在抵抗肿瘤的过程中起到积极作用，目前已有较多关于TLS提高肿瘤免疫的机理及其临床应用已经有了非常多的报道。本期我们将对如何利用HALO数字病理图像分析平台，对TLS的识别、组成与结构、定量检测以及在临床前研究进行介绍。

首先小编带大家先了解下TLS的组成及常见的检测标记物。TLS是异位淋巴细胞聚集形成的组织，有许多免疫细胞参与其组成，包括B细胞，滤泡树突状细胞 (FDC)，浆细胞、T细胞，成纤维网状细胞 (FRC)，基质细胞，树突细胞，中性粒细胞，巨噬细胞，以及内皮细胞等。其中，FDC通常位于B细胞中心，表达各类受体，促进抗原递呈至B细胞以及促进B细胞表达高活性的抗体。内皮细胞位于TLS边缘。此外，在T细胞区域内，也有一些FRC，此类细胞与体内微环境结合，调解T细胞的功能。TLS可以以不同的成熟状态存在于肿瘤组织中，最高级可以形成生发中心结构。
 

图1 癌症中TLS的组成结构

不同细胞在免疫组化中可以被不同的标记物染色，可用于对TLS 的鉴定和识别。表1列出了常用的TLS成分的检测标记物。
 

表1 TLSs的组成及标记物的检测

与肿瘤微环境相关的细胞类型较多，结构复杂，不同类型的肿瘤具有不同的TME。如何从组织中识别检测和量化TLS 是目前的热点问题。下面我们通过几篇关于HALO在TLS研究中的应用来介绍如何在肿瘤微环境中对TLS进行研究。

01  B细胞的浸润以及TLS作为软组织肉瘤患者的预后及免疫治疗生物标记物
 
法国国家健康与医学研究院的免疫学教授Wolf Fridman通过分析软组织肉瘤（STS）临床队列研究，发现软组织肉瘤中B细胞的浸润以及三级淋巴结构与病人的预后以及对免疫治疗的响应呈正相关。

为了探索软组织肉瘤响应免疫治疗的机制，研究团队从分析STS肿瘤微环境中免疫细胞组成入手，分析了608个软组织肉瘤的基因表达谱。根据免疫相关基因表达的多少，将STS分为五类不同的肉瘤免疫类型（sarcoma immune classes，SICs），标记为A、B、C、D和E。其中SIC A为免疫匮乏型，低表达免疫细胞和血管内皮细胞相关基因；SIC B的免疫组成复杂，总体免疫反应弱；SIC C高表达血管内皮细胞相关基因；SIC D的免疫组成也为异质性，但总体免疫反应强；SIC E高表达免疫细胞相关基因，特别是B细胞相关基因，T细胞活化相关基因以及免疫检查点基因的表达在E亚群中表达也较高。

随后探索不同SIC组的临床生存情况，发现和SIC D和E相比，SIC A具有更短的总体生存率。表明根据免疫微环境组成对软组织肉瘤进行分类能够较好的预测肿瘤患者生存率。由于SIC E中高表达B细胞和T细胞相关基因，根据T, B细胞分别对肿瘤患者重新进行生存分析，发现和CD8+ T细胞表达特征相比，B细胞表达特征与更好的总体生存情况呈正相关（图2）。
 

图2 根据CD8 T细胞或B细胞系的表达特征对STS患者进行生存分析

三级淋巴结构（TLS）是机体中的异位淋巴器官，其在肿瘤部位的非淋巴组织中发展，主要由T细胞，B细胞和DC细胞组成。对STS肿瘤组织进行免疫染色，发现免疫反应强的SIC E中存在大量TLS，且TLS表现为更成熟的次级滤泡样TLS，有TLS的肿瘤中也有更多的T细胞和B细胞的浸润；而免疫反应弱的SIC A中基本不含有三级淋巴结构（图3）。这表明三级淋巴结构可以作为免疫反应强的软组织肉瘤的标志物，并且与肿瘤患者预后呈正相关。
 

图3 TLSs是免疫高级别STS的一个显著特征。

最后作者探索免疫微环境组成是否也能预测患者对PD1等免疫检查点阻断疗法的响应性。使用pembrolizumab（PD1单抗）对47个软组织肉瘤患者进行治疗，结果显示SIC E组对ICB治疗有更好的响应和总体生存情况（图4）。这表明这种新型软组织肉瘤分类方法有助于预测肿瘤患者对PD1免疫疗法的敏感性。也就是说，STS中免疫细胞浸润的多少以及类型与肿瘤的预后以及对CPI治疗的响应密切相关。
 

图4 肉瘤免疫微环境免疫类型对PD-1免疫检查点抑制剂治疗的反应密切相关

该研究根据免疫微环境组成这个全新的视角对软组织肉瘤进行分类，发现该种分类方式能够较好的预测病人对PD1免疫疗法的敏感性，并且还揭示B细胞以及三级淋巴结构在肿瘤免疫治疗中的重要作用。在研究中，对于TLS的评估，使用HALO图像分析平台进行TILS的识别。当发现DC-LAMP染色的CD3聚集簇与CD20聚集簇同时高表达时，认为是肿瘤呈TLS阳性。另外，分析中只考虑60000μm2以上，总细胞数大于700个细胞且CD20阳性细胞不少于350个以上的聚集簇。

02  TLS与局部晚期尿路上皮癌治疗的完全缓解相关（NABUCCO试验）
 

抗PD1和抗CTLA4抗体的术前免疫疗法在黑色素瘤和大肠癌中显示出显著的病理反应。荷兰癌症研究所的团队在开展的NABUCCO（NCT03387761）的单臂可行性试验中，研究了接受两剂ipilimumab和两剂nivolumab治疗的24例III期尿路上皮癌（UC）患者切除的组织样本。

发现11名患者（46％）出现病理完全缓解（pCR），达到了次要疗效终点。14名患者（58％）没有剩余的浸润性疾病（pCR或pTisN0/pTaN0）。与抗PD1/PD-L1单一疗法的研究相比，ipilimumab + nivolumab的完全应答与CD8+或T效应细胞的基本存在情况无关。在应答的患者中观察到治疗后诱导的三级淋巴结构初步形成。这些结果表明，CTLA-4联合PD-1阻断可能是有效的术前治疗策略。

在研究过程中，作者使用多重免疫荧光染色和HALO定量图像分析的方法对TLS的结构进行可视化分析并量化TLS的成熟阶段。基线TLS的数量与治疗反应之间未观察到相关性。治疗反应的分析显示，达到CR的患者肿瘤中TLS显著富集。研究中HALO识别尿路上皮癌组织中肿瘤、间质组织分型，并定量检测CD3、CD8、FoxP3、CD68、CD20及Pan-CK肿瘤免疫细胞的浸润程度。（图5）
 

图5 术前ipilimumab和nivolumab的B细胞分析和TLS动态评估

03  TLS作为新辅助疗法治疗不符合顺铂化疗的可手术性高危尿路上皮癌的预测性生物标记物
 
免疫检查点疗法正在针对局部尿路上皮癌的新辅助治疗中进行测试，美国德州大学MD安德森癌症中心的研究人员将免疫检查点抑制剂Tremelimumab（抗CTLA-4）和Durvalumab（抗PD-1）联合进行治疗局部尿路上皮癌，得到了安全性和疗效较好的治疗结果。

对于尿路上皮癌患者，标准疗法包括基于顺铂的化疗，然后进行手术。但是由于肾功能不佳，心力衰竭或神经病等疾病，多达一半的患者不符合顺铂治疗的条件，因此没有标准的治疗选择。该研究招募了28例不符合顺铂标准治疗的高危局部尿路上皮癌患者，每位患者均接受了两种剂量的Durvalumab和Tremelimumab的联合治疗，有24位患者在治疗后完成了手术。其中9例（37.5％）达到了病理完全缓解（pCR），这意味着手术时没有明显的癌症迹象。此外，在12例肿瘤特别大的患者（T3-T4期）中，pCR率为42％，一半的患者肿瘤大小降至T1期或更小。大多数患者经历了与免疫相关的副作用，其中最常见的是1-2级皮疹（29％）和无症状的淀粉酶升高（29％）。6名患者（21％）经历了3级或更高的免疫相关副作用，包括无症状的实验室异常，肝炎和结肠炎。没有发生与治疗有关的死亡。

研究人员还收集了患者治疗前后的血液和组织样本，以及与反应相关的生物标记物。他们从对联合疗法反应良好的患者的治疗前肿瘤样本中发现了更高密度的称为三级淋巴结构（TLS）的免疫细胞簇，TLS密度越高，总体生存期越长，无复发生存率越高（图6）。尽管这些发现需要在更大的研究中得到证实，但数据表明TLS可以作为对免疫检查点阻断有反应的患者有用的预测性生物标志物。

本研究中通过表达CD20和CD3的淋巴细胞聚集簇，以及形态上与生发中心内的淋巴组织相似定义TLS。对单标记IHC分析，使用HALO进行了全面的评估，包括TLS中的CD20、CD4、CD8的阳性细胞数及细胞密度。
 

图6 治疗前肿瘤组织样本中TLS的分布及与生存期分析

04  三级淋巴结构中B细胞异质性与转移性黑色素瘤患者的生存相关
 
TLS是外周组织中的免疫聚集体，可以支持适应性免疫反应。它们的存在与检查点阻断疗法 (CBT) 的临床反应有关，但尚不清楚 TLS 是否具有独立于黑色素瘤 CBT 的预后意义。研究假设黑色素瘤转移中的 TLS 与肿瘤内淋巴细胞浸润增加有关，但 TLS 内免疫环境与肿瘤内免疫环境不同。同时还假设 TLS 的存在与生存率的提高有关，并且 TLS 成熟或 TLS 内淋巴细胞活性也与生存率相关。

来自弗吉尼亚健康系统大学的Kevin博士对来自64名皮肤黑色素瘤转移 (CMM) 的患者样本通过多重免疫荧光评估 TLS 的存在和成熟状态。分析了TLS的淋巴细胞密度，增殖和 B 细胞 Ig 体细胞超变 (AID+)，以及T细胞耗竭和 Th1/Tc1 分化的标志物。评估了TLS成熟与TLS内免疫活性之间的关联，以及与肿瘤内免疫细胞浸润的关联。

研究发现在64名 CMM (TLS+) 中的 30 名 (47%) 中发现了 TLS，并且与肿瘤内淋巴细胞浸润增加有关。然而，TLS 内淋巴细胞的增殖与肿瘤内淋巴细胞增殖无关。大多数是早期的 TLS，初级或次级滤泡样 TLS 的子集也存在。在多变量分析中，TLS+ 病变与转移瘤切除术后肿瘤复发风险较低以及 OS 改善相关。CD21+ B 细胞比例低的 TLS 的 OS 更长，而 AID+ B 细胞比例低的 TLS 的 OS 更短）。

该研究中，作者使用HALO对TLS内淋巴细胞的数量、密度进行了全方面的分析。例如进行淋巴细胞密度的分析并进行细胞密度归一化处理，计算出表达某一激活或分化标记物的分数。标准化密度用于所有TLS内或肿瘤内淋巴细胞激活或分化标记表达的比较，以及所有与TLS内淋巴细胞表达这些标记相关的患者预后评估。
 

图7 TLS图像示例及免疫细胞密度评估

 
图8 eTLS早期三级淋巴结构、pTLS原发性滤泡样三级淋巴结构、sTLS次生滤泡样三级淋巴结构的代表性图像(分别为左、中、右列)。(A) CD20+CD21+CD23+染色；(B) CD20+染色；(C) CD21+网状结构的染色(pTLS和sTLS)；(D) CD23+生发中心样结构(仅sTLS)。

TLS因为其特殊的分布位置以及强大的免疫功能，在肿瘤免疫过程中发挥越来越大的功能。使用HALO数字病理图像分析平台，可以全方位的对肿瘤微环境内TLS的数量、空间位置分布以及TLS内淋巴细胞的数量、表型等信息进行全方面的分析。联合空间转录组学和单细胞转录组学的分析策略，可以针对TLS的特殊结构、细胞组成与基因表达情况，深入解析肿瘤的免疫机制和临床免疫治疗，在未来的科学领域将发挥重要的作用。

参考文献：
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