Biacore检测蛋白与小分子相互作用

小分子一直是分子互作研究的热门对象，通常指分子量小于1000道尔顿的分子，如化药、中药、多肽、植物激素、金属离子等。小分子相互作用检测由于其分子量小，响应值低，亲和力弱等特点，对仪器灵敏度提出了很高的要求。Biacore灵敏度最高可达0.015RU，无分子量检测下限，优于市面同类产品技术上百倍，一天可分析多达400个样品。因此，Biacore成为了小分子互作检测的必备工具。
Biacore在小分子领域的研究涉及了生命活动的很多方面，如：
(1) 化药研发
(2) 多肽研究
(3) 中药活性成分研究
(4) 植物激素
(5) 食品含量测定
(6) 农药残留检测
(7) 疾病的分子机理研究等
接下来使用BiacoreT200仪器，解析蛋白与小分子互作实验操作流程。

Biacore T200 检测蛋白与小分子互作操作指南

实验前准备
•   S 系列 CM5 芯片，货号：29-1049-88( 一片装 )、BR-1005-30( 三片装 )、29-1496-03( 十片装 )，若蛋白与小分子的分子量比大于 100，换用 S 系列 CM7 芯片。( 注：每张芯片若一次性使用，可检测三对不同的互作，若再生后重复使用，只要蛋白一直有活性，就可一直使用 )。
•   氨基偶联试剂盒( 货号：BR-1000-50),( 注：里面的 EDC 和NHS，溶解后，200ul 每管分装，-20℃冻存， 后续实验前，各取一管融化后使用即可 )。
•   偶联 Buffer：10mM 醋酸钠 pH4.0( 货号：BR-1003-49) 或 10mM 醋酸钠 pH4.5( 货号：BR-1003-50)。

•   缓冲液：10 x PBS-P+ ( 货号：28-9950-84)。

•   分析纯 DMSO，去离子水 (0.22 μm 膜过滤，若纯水仪已含该滤芯，可无需再次过滤直接使用 )。

•   蛋白：浓度一般需大于 0.5 mg/ml。蛋白总量至少 20 μg 以上。

•   小分子 LMW：母液浓度建议大于 20 mM，体积在 30 μL 以上，纯度 >90%，溶在 100% DMSO 里。

•   其他耗材：无盖 1.5 ml EP 管( 货号：BR-1002-87)，橡胶瓶盖 2 型( 货号：BR-1004-11)，96 孔板( 货号：BR-1005-03)，96 孔板封口膜 ( 货号：28-9758-16)。

实验步骤
芯片的放置与缓冲液置换
•   将运行缓冲液 (200 mL 1×PBS Buffer 即可 )，水瓶，废液瓶分别放置在左右托盘中，并插入相应的进液管。
•   点击 Biacore T200 Control Software 工具条中的 或 点击 Eject Chip，打开芯片舱门。选择 New Chip，现在 Chip type 为 CM5。

•  手持芯片，有字的一面朝上。按照芯片上的箭头方向，将芯片轻轻推入卡槽，最后合上芯片舱的舱门。点击 Dock Chip。结束后，选择 Tools → Prime 命令，点击 Start。结束后，点击 Close，系统自动转入待机 (Standby) 状态。

蛋白偶联
•   点击控制软件 File 下面的 Open/New wizard template，选择 immobilization，双击。在 Chip type 中选 CM5，在 Flow cells per cycle 选 1。勾选 Flow cell 2 (如 2 已用，可选择 4)，method 选用 amine， Ligand 输入配体名称，选用 specify contact time and flow rate 实现高偶联，按下表输入 contact time，本次实验输入 900s。点击 2 次 Next。

表 1. 偶联量与配体工作浓度参考表

分子量比（蛋白 / 小分子）	≤50	50~100	>100
芯片类型	CM5		CM7
目标偶联量	~8000 RU	~15000 RU	>20000 RU
配体工作浓度	20μg/mL	40 μg/mL	50 ug/mL
contact time	600s	900s	900s

•   在左侧下拉菜单中选用Sample and Reagent Rack 1，在 Menu 里选Automatic Positioning 自动排放样品位置或自行通过鼠标拖拽到指定位置。根据下图中样品名称及体积( 大于该指定体积即可 ) 进行样品准备。其中配体蛋白用 pH4.0 的醋酸钠稀释至 50 μg/mL ( 或按上表配制相应浓度 )。点击左下方 Eject Rack，取出样品架，将准备好的样品放到对应位置。盖上试管架盖子，将样品架送回样品舱。( 注：所有 EP 管的盖子务必剪去 )。
  

•   点击 Next，点击 start，保存 method 与 result 文件。系统将自动在芯片表面包被目标偶联量的配体蛋白，并自动生成偶联报告。
•   偶联结束后，即可进入下一步实验，无需等待基线平衡。

运行缓冲液及样品配置
•   配置运行缓冲液和溶剂校正曲线

小分子样品的运行缓冲液选用含 5%DMSO 的 1×PBS-P+（视样品溶解性可调整 DMSO 含量，最高不超过 10%）
取 105 mL 10×PBS-P+ 用去离子水稀释到 1L，配成 1.05×PBS-P+。并按照下表，加入 DMSO，配置5%DMSO 运行缓冲液和 4.5%、5.8% 溶剂校正母液（running buffer 中 DMSO 浓度并非绝对 5%，可视小分子样品溶解度情况而定，0-10% 均可。若 running buffer 中 DMSO 浓度变化，则溶剂校正母液也相应变化，只要 cover running buffer 中 DMSO 浓度即可）。将系统左侧托盘中的原运行缓冲液换成含 5%DMSO 的 1×PBS-P+，并插入相应的进液管。

	4.5% DMSO	5.8% DMSO	5.0% DMSO running buffer
1.05 x PBS-P+	9.5ml	9.5ml	950 ml
100% DMSO	0.45ml	0.58 ml	50ml
Final volume	~ 10 ml	~ 10 ml	1000

按照下表混合 4.5% 和 5.8% 母液配置 5%DMSO 浓度校正曲线(DMSO 标准液的数量并非一定要 8 个， 通常 4-8 个均可。总体积也并非一定要 1.4ml，这些均可根据实际情况自行调整 )

Buffer/Vial	1	2	3	4	5	6	7	8
4.5% DMSO	0	200	400	600	800	1000	1200	1400
5.8% DMSO	1400	1200	1000	800	600	400	200	0

•   小分子样品准备

用不含 DMSO 的 1.05×PBS-P+ 缓冲液稀释 20 mM 小分子母液 20 倍，得到 1 mM 含 5%DMSO 的1×PBS-P+ 中的小分子 400 μL，再用配好的含 5% DMSO 的 Running Buffer 将分析物向下三倍稀释 10个浓度梯度 ( 各 200 μL)，分别是 1000 μM, 333.3 μM, 111.1 μM, 37 μM, 12.3 μM, 4.1 μM, 1.37 μM, 0.46μM, 0.15 μM, 0.05 μM。间隔设置一个重复浓度，增加一个 0 浓度。

多循环动力学检测
•   点击控制软件 File 下面的 Open/New Method，然后双击打开 Biacore Methods，再双击 LMW kinetics。
•   在 General Settings 界面，将 Concentration unit 改为 μM，Detection 改为 Dual，若 flow cell 2,3,4 都偶联了蛋白，Detection 下面可以选 Multi，后面对应的第 5 步可选 2-1,3-1,4-1，其他不做修改。

•   在Assay Steps 界面，可以调整检测项目和重复次数。Startup 和sample 的重复次数通常分别为3 和1， solvent correction 通常检测开始时一次，结束时一次，每隔 30cycle 一次。检测温度默认 25 度，也可根据需要进行修改等。如无 control sample，可在此页面选择 control sample 后，点击左侧 Delete 按钮，将其删除。
•   在 Cycle Types 界 面，选择 LMW kinetics，点击下方 Sample1，将 Contact time 改为 60s， Dissociation time 改为 120s。其他项无需修改。Extra wash 用 50%DMSO 清除管路中残留的小分子(extra wash 不流经芯片表面，不会影响配体活性 )。
  

•    点击 Verification，如果方法有问题，在此页面会报错，并根据报错提示返回相应步骤进行修改。如果无问题，点击 setup Run。在 detection 界面将 Flow path 点为 2-1 或 4-3（具体视蛋白偶联的通道而定）。

•   点击 next， 进入分析物信息填写。Startup 中 Sample solution 填写 PBS-P+，Sample 中 Sample solution 填写样品名称，Conc 填写分析物系列浓度（由低到高、三倍稀释）。注意要设置重复浓度和零浓度。推荐浓度如下：

 
•  点击 3 次 Next，进入 Rack Positions 界面，将 Reagent Rack 改为 Sample and Reagent Rack1（若需要用96/384 孔板，则选择Reagent Rack1 或2，同时在下方96 well microplate 中选择对应的孔板类型）。点开 Menu 后选 Automatic Positioning 进入下面界面后， Vial Size 根据需求进行调整，1.5 mL EP 管请选择 medium，pooling 选择 Yes（相同的样品会自动合并），点击 OK。点击左下方 Eject Rack， 取出样品架。根据图示样品位置进行放置，放入样品体积略大于显示体积即可。注：所有 EP 管的盖子务必剪去。盖好橡胶盖防止挥发，并按指定位置放置。盖上试管架盖子，将样品架送回样品舱。点击 Next，对方法进行保存，再对数据路径（可使用系统 默认的，也可自行指定，注意所保存的文件名及指定文件夹名均不能有中文字符）进行保存，仪器便会开始自动运行。

结果分析
•   打开 Biacore T200 Evaluation Software，点击  ，找到保存的结果文件。点击左侧 Plot 中的Binding to reference，检查各个点是否趋于一致或小于 binding level 中对应响应值的 20%，再检查binding level 各个点的响应值是否存在明显的浓度依赖。如是，直接跳到下一步。注：若 Binding to reference 各个点的响应值也存在浓度依赖且大于binding level 中对应响应值的 20%，即存在非特异性结合。此时可尝试提高运行缓冲液中盐离子浓度或提高 P20（货号：BR-1000-54）浓度不超过 1%。若 baseline 中各个点的响应值上飘，可加入再生步骤。
•   点击 solvent correction 进行溶剂校正分析。溶剂校正曲线一般要求落在 -500 到 +1000RU，两条竖线落在矫正曲线范围内，拟合的 Chi2 小于 2。如果超出此范围较多，多由于 DMSO 浓度配置不准确造成。最后，点击 OK。
 

•   点击上方中间位置的 Kinetics/Affinity，在下拉栏里点击 Surface bound。在跳出的窗口中选择合适的、至少 5 个连续浓度进行拟合。不需要的浓度，可在样品浓度表格中将此浓度前的对号去掉即可。Curve 选择 FC=2-1corr（或 FC=4-3corr）。

•  点击右下角 Next，选择右下角 Affinity（当传感图为 “ 时间依赖的动力学特征 ” 时，选 Kinetics，所以本实验也可用 kinetic 拟合），点击 Next，Model 选择 Steady State Affinity，点击左上角 Fit 进行数据拟合，点击右下角Finish 完成。经拟合，小分子LMW 与该蛋白pro 的亲和力KD=1.427x10-4 M。（对于亲和力拟合，KD 竖线最好落在样品浓度范围内，并尽量小于最高浓度的一半位置，若 KD 竖线＞最高浓度，则可提高进样浓度梯度，或在上一步选择更高浓度的、至少 5 个连续浓度的样品进行拟合。)
 
 

•   将鼠标放在图上，点击右键可以直接 copy graph（small，medium，large）用于文章发表，也可以右键点击 export curve，导出 txt 文本后自行用第三方软件作图。

相关试剂：

货号	产品名称	规格
29104988	Series S Sensor Chip CM5-1-pack	1片
BR100530	Series S Sensor Chip CM5	3片
29149603	Series S Sensor Chip CM5, 10-pack	10片
BR100050	Amine Coupling Kit	/
BR100349	Acetate 4.0	50ml
BR100350	Acetate 4.5	50ml
BR100352	Acetate 5.5	50ml
BR100351	Acetate 5.0	50ml
BR100357	Glycine 3.0	100ml
BR100356	Glycine 2.5	100ml
BR100355	Glycine 2.0	100ml
BR100354	Glycine 1.5	100ml
28995084	PBS-P+ 10X	1L
BR100672	PBS-N 10X	1L
BR100287	Plastic Vials 1 5 ml	/
BR100411	Rubber Cap type 2	/
BR100503	Microplate  96 well	/
28975816	Microplate Foils (96 well)	/