新手怎么研究翻译后修饰（PTMs）？6大实验Tips助力PTMs研究

翻译后修饰(PTMs)，如磷酸化、乙酰化、sumo化、泛素化等，可使蛋白质组的复杂性大大增加。PTMs在信号转导、蛋白稳定和转换、蛋白识别和相互作用、空间定位等方面发挥着重要作用。由于PTM在基础生物学和疾病发病机制中的重要性，识别每个靶蛋白(protein of interest：POI)的PTM调节机制具有重要意义。

对于新入门的小白，下图可以帮你快速入手PTMs相关研究：
 

基于免疫沉淀（IP）实验的技术

免疫沉淀(IP)PTMs研究中的主要实验方法，IP法允许研究者在目标POI上富集特异性、低丰度的PTM修饰，富集是通过亲和纯化技术实现的。  
 
附着在固体支撑基质(如琼脂糖树脂)上的抗体(或特异性结合分子)与POI或PTM结合，而复合物裂解液中的非靶向蛋白不会被捕获并通过洗涤步骤去除。然后，用洗脱缓冲液将富集的蛋白质从琼脂糖珠中除去，并在分离成浓缩溶液。分离的溶液通过其他实验方法进行分析，如western blot（WB）或质谱，以确定POI是否在翻译后修饰。 图1显示了IP实验的基本步骤： 

图1. 免疫沉淀PTM修饰蛋白的一般性实验流程。

实验成功Tips：

1.  选择合适的亲和试剂:  
高质量的亲和试剂是研究低丰度PTM修饰的关键
- 利用PTM亲和试剂，捕获想要研究的PTM 
- 能够研究PTM内源性变化的PTM试剂是有益的
- PTM IP vs.靶蛋白IP富集(见下文)
- 抗体与亲和基质结合会显著减少重链和轻链浸出

2. 选择合适的裂解液系统:  
大多数研究人员使用非变性裂解缓冲液(例如RIPA)。然而，在某些情况下，需要使用替代缓冲液; 例如，当试图分离像组蛋白（Histones）这样的DNA结合蛋白时。  
- 选择合适的缓冲系统可能会对阳性或阴性的PTM识别产生影响  
- 举个例子，sumo化需要在变性缓冲系统中研究  
- 其他PTMs会更稳定，但也可能受益于变性条件  

3. 选择合适的抑制剂:  
- PTM抑制剂是一种添加到裂解缓冲液中的化学物质，用于抑制针对特定PTM的异肽酶(例如去泛素酶抑制剂)。  
- 识别关键的抑制剂对于成功检测瞬态PTMs至关重要。  
- 当研究多个PTMs时，在裂解缓冲液中补充抑制剂是很重要的，而且可能需要单独验证两种结果，以确保抑制剂混合物没有交叉反应性。  
 
4. 选择合适的对照珠子:  
- 对照珠可以让研究人员区分真正的PTM信号，或者非特异性结合亲和基质的“粘性”蛋白的假阳性信号。  
- 适当的对照珠有IgG抗体结合到珠，以最佳的复制条件，任何非特异性的相互作用将被检测。
- 适当的控制珠也可以用于裂解液的预清除。相关例子在文章《Signal-SeekerTM翻译后修饰（PTMs）试剂盒：实验优化Tips及常见问题》中有更多呈现，详情请见文末。
 
5. 选择合适的对照:  
合适的对照可以让研究者更容易地推断他们的结果。  
- 对照实验包括阳性对照和阴性对照，这对结果的准确推断很重要  
- 根据文献中的信息，可以确定感兴趣的目标蛋白被修饰或未被修饰的条件  
- 其中一种阴性对照的方法是：在没有PTM抑制剂的缓冲液中裂解细胞，这应该会导致信号减弱或缺失。
- 一篇与PTM修饰蛋白相关的文献可供参考，在没有PTM抑制剂的情况下，修饰会减少。（Identifying Regulatory Posttranslational Modifications of PD-L1: A Focus on Monoubiquitinaton）
- 另一个重要的对照是HRP标记的针对靶PTM的泛抗体。 这可用于评估PTM的富集水平。

6. 选择合适的检测方法:  
尽管比色和荧光检测方法可以给你所要研究的靶蛋白提供敏感、线性的WB信号,我们强烈建议使用超灵敏化学发光检测试剂,因为它的敏感度通常是荧光检测法的10倍，比色法的20倍。  
 
7. 选择合适的一抗:  
高质量的一抗非常重要。  
- 不要使用高背景的一抗  
- 要使用敏感性高的一抗  
- 使用多种抗体进行信号验证是更有利用实验准确结果的获得。

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