GST标签

1、Glutathione Sepharose HP、 FF和4B填料，有什么特点？
答：HP：High Performance，高性能，填料平均颗粒大小约34 μm，颗粒细能带来高分辨率的分离纯化。HP纯化后峰更窄，样品浓度高，节省了浓缩步骤的时间，但会带来更高的反压，因此流速更慢。FF：Fast Flow，快流速，填料平均颗粒大小约 90 μm，较 HP 颗粒粗，流速快，具有良好的分辨率及轻松实现规模扩大的分离纯化。4B：载量高，适合于重力纯化，但是骨架软不耐压，不建议用于规模放大。

2、纯化 GST 标签蛋白时，目标蛋白结合弱或者不结合是什么原因？
答：可能的原因以及解决方法如下 ：
(1) 样品制备超声过度 / 不够 ：加入溶菌酶促进裂解。
(2)GST 氧化聚集 ：加入 DTT( 常用 1 – 10 mM) 能增加蛋白的结合。
(3) 结合条件 ：确保结合缓冲液的 pH 在 6.5 – 8 之间，否则结合效率低 ； GST 结合动力学慢，可降低上样流速。
(4) 载量不够 ：使用更大体积的柱子。 
(5) 确保柱子按说明书正确再生处理。
(6)GST 构象改变，结合较弱 ：验证 GST 空载蛋白的表达及结合填料的能力，看是否由于重组蛋白影响了 GST 构象。可以降低结合温度至 4℃并减少 wash 清洗次数。

3、纯化 GST 标签蛋白时，纯度不够，应如何改进？
答：可能的原因以及解决方法如下 ：
(1) 蛋白降解 ：避免过度超声 ；添加蛋白酶抑制剂PMSF 或AEBSF ；确保使用蛋白酶缺失的宿主，如E. coli BL21 ；使用GSTrap FF 增加上样流速缩短上样时间。
(2)70 kDa 伴侣蛋白共洗脱 ：纯化前使用含有2 mM ATP， 10 mM MgSO4，50 mM Tris-HCl (pH 7.4)的缓冲液在37℃ 孵育 10 分钟，以解离复合物 ；或者增加后续的纯化步骤。

4、GST 标签切除的方法有哪些？
答：根据不同载体选择不同的酶进行酶切 ：
(1)PreScission Protease (27084301) 可在 4℃下酶切，并自身含有一个 GST 标签，可通过 GST 柱去除。
(2)Thrombin (27084601)•或 Factor Xa (27084901) 需要室温下酶切，酶切后可用苯甲脒的柱子 HiTrap Benzamidine FF 一步去除多余的酶。

5、GST 柱子出现堵塞，应该如何清洗？
答：(1) 去除沉淀或变性的物质 ： 2 倍柱体积 6 M 盐酸胍，然后用5 倍柱体积 pH 7.3 的 PBS 平衡。
(2) 去除疏水结合的物质 ： 3 – 4 倍柱体积 70% 乙醇( 或者 2 倍柱体积 1% Triton X-100)洗涤，之后立即用 5 倍柱体积 pH 7.3 的PBS 平衡。

6. GST标签蛋白使用GST预装柱，能挂柱，但是洗脱不下来，原因和解决方案？
原因：很有可能蛋白不溶，沉积在柱子上。
解决方案：可以增加洗脱缓冲液的量，增长洗脱时间。还原型谷胱甘肽大多数情况下的浓度是10 mM，此时可以提高至20 – 40 mM，还原型谷胱甘肽建议现配现用，配制过程中需要调节pH，当pH在8 – 9时可促进洗脱。也可以增加盐浓度或者加入DTT来促进洗脱。如果蛋白与填料间发生非特异疏水相互作用，可以在洗脱缓冲液中加入非离子型去垢剂triton 100来改善。此外，还可以加尿素或盐酸胍等变性剂来洗脱，但是变性剂会破坏蛋白的构象，从而影响其功能活性。