离子交换层析

1、强离子交换与弱离子交换有什么差别？
答：强离子交换与弱离子交换的差异在于强离子交换为完全电离，弱离子交换为部分电离。强离子交换在较宽的 pH 范围内有着比较稳定的载量，而弱离子交换会随 pH 的不同结合的强度与载量有改变，所以，能提供更多的选择性。一般推荐先尝试强离子交换，在选择性不好的时候可以再尝试弱离子交换。

2、填料粒径如何影响离子交换的分辨率？
答：相对来讲，填料的粒径越小则分辨率越高，一般分辨率由高到底为：Capto HiRes(9 µm)、Source 15(15 µm)、Source 30(30 µm)、High Performance(HP，34 µm)、Capto ImpRes(40 µm)、Capto ImpAct(50 µm)、Capto(90 µm) 和 Fast Flow(FF，90 µm)。但是粒径越小，反压也越高。
而填料装填的高度越高分辨率也越高。另外，预装柱的柱效更佳。

3、新一代改良交联琼脂糖基架 Capto和上一代Sepharose 填料替换关系和区别？
答：Capto 基架和 Sepharose 相比，流速更快、载量更高、刚性和化学耐受性更好。
替换关系如下：
• Sepharose Fast Flow (90 um)，替换为 Capto (90 um) 填料；
• Sepharose High Performance (34 um) ：替换为 Capto ImpRes (40um)，分辨率相当，但是流速更快；
• 高分辨率： Mono Q/S 替换为 Capto HiRes Q/S
• 适合 100 KD 以上生物大分子的应用： Capto Q XP， Capto S ImpAct
• 另外，还有多模式弱阳离子交换填料 Capto MMC 以及强阴离子交换填料 Capto adhere，提供更优的选择性，可改善工艺。

4、针对未知样品，如何选择离子交换层析填料和操作条件？
答：自然界中绝大部分蛋白的 pI 在 5.8 或 9 附近，偏酸性更多。
因此，针对未知样品，一般首先推荐强阴离子交换层析，如Capto Q，使用中性缓冲液 pH 7-8。如果 Q 挂不上，可以再尝试强阳离子交换 Capto S 或 SP，选择 pH 5-6 范围。另外，可以选择样品流穿，杂质挂柱。 HiTrap Capto IEX Selection Kit( 货号28934388)，含 Capto S、Capto Q、Capto DEAE、Capto adhere 以及Capto MMC 1mL 预装柱各一支，后两个为多模式填料，可用于填料筛选。

5、离子交换产品应该如何选择缓冲液和操作 pH 值？
答：一般操作 pH 高于等电点时选择阴离子交换，反之选择阳离子交换。等电点可以通过 Expasy 软件预测，或使用等电聚焦、滴定法检测。建议进行 pH Scouting 筛选最佳分离 pH 条件，或者从偏离 pI 值 1 以上开始尝试。
阴离子交换常用缓冲液和最佳缓冲范围如下：

阳离子交换常用缓冲液和最佳缓冲范围如下：

如果样品的电荷条件未知，可以先尝试一下条件：

6、DEAE 填料使用 NaOH 清洁再生或稀碱保存后，很难平衡到中性 pH。如何处理？
答：DEAE 配基为 -CH2-CH2-N+-(CH2-CH3)2，类似弱碱盐， N+ 会结合 NaOH 中的 OH-，且 OH- 很难解离。建议直接上 10 X 平衡缓冲液母液（离子强度大概 0.5 M），例如 10X PB，走 0.5-1 个柱体积即可平衡到正常 pH。

7、科研领域，植物或动物中多糖组分的纯化，选择什么填料？
答：酸性多糖 ( 最常见 ) 可以通过 DEAE 或 Q 阴离子交换填料进行分离，碱性多糖可以通过 SP 或 CM 阳离子交换分离。在已有的文献中，经常报道使用 DEAE 进行羧基化多糖纯化，使用 Q 填料纯化硫酸化多糖和磷酸化多糖。洗脱一般通过改变 pH 或盐梯度进行。
经典多糖 2 步纯化：第一步阴离子交换 DEAE Sepharose FF 或Capto DEAE，第二步分子筛 Sephacryl S 系列，或更高分辨率的 Sepharose 系列和 Superose 6 increase。

8、实验室中纯化溶解在水中的多糖样品，用水平衡柱子后，直接上样（多糖溶解在水中），重复性不好，如何处理？
答：为了促进样品结合且保证重复性，建议实验前，使用中性缓冲液 ( 如 20 mM Tris-HCl， pH 7.8) 平衡柱子，然后水洗，上样。

9、如何选择疏水填料？
答：由于样品和杂质的疏水性较难预测，且不同疏水配基具有不同的选择性，建议购买 HiTrap Capto HIC Selection Kit ( 货号 29321087) 或 HiTrap HIC Selection Kit( 货号 28411007) 筛选最佳填料。需要注意影响填料疏水性的因素包括配基疏水性、配基密度和基架。如果只想先尝试一种，可以从疏水性最强的Capto Phenyl High Sub(HS) 开始尝试，货号 17545108， 1 mL 或17545109， 5 mL。

10、离子交换如何进行清洗？
答：常规清洗（建议定期）
1、2CV 2M NaCl
2、4CV 1M NaOH
3、2CV 2M NaCl
4、至少2CV去离子水清洗直到UV到基线或者流出液PH稳定
5、至少4CV结合缓冲液或储存液清洗直到PH和电导稳定

CIP
去除强疏水作用结合的蛋白、脂蛋白和脂类：4CV 30%异丙醇或者70%乙醇
去除沉淀的蛋白：1CV 1mg/ml胃蛋白酶，0.5M NaCl，0.1M醋酸或者2CV 6M盐酸胍