凝胶过滤层析

1、凝胶过滤层析原理？
答：凝胶过滤是一种常用的纯化方法，基本原理是根据样品分子的大小与形状进行分离，属于非吸附型层析。凝胶过滤层析填料为多孔的小球，样品上样后，分子量较大的蛋白不能进入到小球孔隙中，路程较短，先被洗脱出来；分子量较小的蛋白会不断进入到小球孔隙中，路程较长，后被洗脱出来。

2、层析柱样品的上样量？
答：分子筛上样量一般为柱体积的2%-5%。
(1)Superdex/Superose Increase 10/300 系列，柱体积 24 mL，推荐上样量 ≤500 μL。
(2)HiLoad Superdex/Superose pg 系列，其中 16/600 柱型，柱体积 120 mL，推荐上样量 ≤5 mL ； 26/600 柱型，柱体积 320 mL，推荐上样量 ≤13 mL。
(3)HiPrep Sephacryl S 系列， 16/60 柱型柱体积 120 mL，推荐上样量 ≤5 mL ； 26/60 柱型柱体积 320 mL，推荐上样量 ≤13 mL
(4)Superdex/Superose Increase 5/150 与 3.2/300，柱体积分别为 3mL 与 2.4 mL，推荐上样量 ≤50 μL。

3、凝胶过滤的缓冲液成分应该如何确定？
答：分子筛属于非吸附式层析，运行时只需要一种缓冲溶液，具有非常好的兼容性，基本上只需要考虑蛋白的稳定性来选择合适的缓冲液。一般在实验中会加入150 – 300 mM的NaCl，以降低离子型的非特异性吸附。若有添加剂的使用，需要参考对应填料的说明书中的化学试剂耐受信息，并且考虑是否需要做空白实验用于扣除添加剂本身对紫外检测的影响。另外，使用不同的溶液时 ( 例如加入了甘油等成分 )，因为溶液本身粘稠度的不同，请适当降低流速以保护柱子。

4、凝胶过滤层析预装柱出现填料被压塌的现象应如何处理？
答：主要可能是流速过快或者超压运行造成的。
如果超压不严重，可以先根据使用说明书进行 CIP 清洗 ( 有必要可以更换柱顶端滤膜 )，之后长时间低流速反向冲洗层析柱，直至在工作流速下胶面恢复至原位置。后续可以进行柱效测定或者重复之前做过的样品，来确定是否可以继续使用。
如果填料上方仍有空隙，可以下调Adaptor至填料顶端以消除空隙。
如果超压严重时，对于可以拆卸的预装柱，可以考虑将填料取出来清洗，去除破碎和板结的填料后再重新装柱。

5、凝胶过滤层析预装柱如果进气泡或者空气怎么处理？
答：反向用脱气的水/20%乙醇冲洗尽量长的时间。（建议反压阀在位）尽量尝试把气泡排除。

6、凝胶过滤层析预装柱如果压力较高，流速较慢怎么处理？
答：很有可能是柱子堵了。此时应该做CIP清洗，或者更换滤膜。

7、凝胶过滤层析填料干裂如何处理？
答：反向低流速冲洗至恢复。如果较为严重，对于可以拆卸的预装柱，可以考虑将填料取出来清洗，去除破碎和板结的填料后再重新装柱。

8、凝胶过滤层析柱如何选择？
答：首先根据目标蛋白的分子量进行选择。目标蛋白的分子量在预装柱推荐分离范围的中间范围时，分离范围最好。
然后根据样品的上样量选择合适体积的柱子。
分离范围：
Superdex 30：0.1-7KD
Superdex 75：3-70KD
Superdex 200：10-600KD
Superose 6：5-5000KD

9、凝胶过滤层析柱如何进行CIP？
答：CIP即为在位清洗的意思。填料在使用10-20次左右，或者柱子堵了的情况下，需要进行CIP。CIP的操作请参考说明书。此处以Superdex Increase系列为例：
使用10到20次之后或者柱子堵塞后可执行以下清洗流程。
注意：执行 CIP 时，建议反向清洗。
1、用 1 个柱体积 (CV) 的 0.5 M 氢氧化钠或 0.5 M 乙酸以 0.13 mL/min (5/150) 或 0.5 mL/min (10/300) 的流速清洗色谱柱；
2、立即用1个柱体积的去离子水冲洗色谱柱，然后使用至少 2个柱体积洗脱液流速为 0.13 mL/min (5/150)或 0.5mL/min (10/300)进行清洗。
在下一次运行之前，平衡层析柱直到 UV 基线和 pH 值稳定。
更严格的清洁：
• 根据污染物的性质，可以使用缓冲液和溶剂耐受性中的溶液进行清洗。使用任何溶液清洗后，务必用至少2个柱体积的去离子水冲洗。
• 如果层析柱性能未恢复，请用3个柱体积的0.5 M 精氨酸清洗层析柱。然后用至少2个柱体积的水冲洗。
• 如果色谱柱性能仍未恢复，则注入含有1mg/mL 胃蛋白酶的 0.1M 乙酸溶液（含有 0.5M NaCl），并在室温下放置过夜或在 37ºC 下放置 1 小时。 酶处理后，根据上述常规清洁步骤清洗层析柱。
• 更改层析柱顶部的滤膜。（由于污染物是随液流一起引入的，因此其中许多被滤膜捕获）。 

10、分子筛上扬后不出紫外峰和样品？
答：样品上分子筛后不出峰，怀疑样品与分子筛具有非特异性吸附，建议用含高盐溶液（PBS+0.5 M NaCl），或者含0.1%非离子型去垢剂冲洗柱子看是否有蛋白冲出。